第一部分 全基因组分析鉴定2010-2019年中国大陆丙型肝炎病毒重组事件和正向选择位点背景:丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（Hepatitis Virus C,HCV）引起的一种病毒性肝炎,目前已成为全球性的公共卫生问题。根据2020年世界卫生组织官方数据显示,截至当年全世界约有七千一百万人（约占世界总人口的1%）患有慢性丙型肝炎,从而导致每年近四十万人死于肝硬化和肝癌。中国的丙型肝炎病毒感染率估计低于东地中海地区（2.3%）和欧洲地区（1.5%）,与全球流行率（1%）相持平,但是,由于中国人口基础大,所以丙型肝炎病毒携带者的数量却是世界上最大的。尽管先前已在中国进行了一些小规模的人口调查和狭窄的地理区域关于HCV基因型的研究,但关于中国大陆流行的丙型肝炎病毒株的重组变异信息和正向选择位点知之甚少。方法:首先,基于NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）,病毒病原体数据库（http://www.viprbrc.org）和 HCV 数据库（https://hcv.lanl.gov）收集了 140 条丙型肝炎病毒的序列,将所有的病毒株序列与参考株H77株序列对齐后,利用MEGA 10软件使用最大似然法构建了进化树进行系统发育分析。然后用RDP5软件和SimPlot软件进行重组分析。在排除具有重组信号的病毒株序列,其余序列与参考序列进行比对,最后使用Datamonkey服务器进行选择压力分析筛选正向选择位点。结果:系统发育分析发现,基因型6型是中国大陆近十年最流行的丙肝基因型之一。用RDP5和Simplot软件进行重组分析确定了五个潜在重组事件,主要包括一个基因型间病毒重组株（HH075株）和四个基因型内病毒重组株（WYHCV286株、GB28株、GZ2983株和HCV156株）。用Datamonkey服务器进行选择压力分析,发现大多数氨基酸位点处于负向选择,而通过SLAC、FEL和FUBAR法鉴定出的正向选择位点数目分别为5、12和7,其中SLAC法鉴定出了 5个位点在另外两种分析方法的结果中也重复出现了。具体而言,五个正向选择位点分别为核心抗原基因中的两个氨基酸位点（氨基酸位点72和75）,E2基因中的氨基酸位点395和NS5B基因中的两个氨基酸位点（氨基酸位点2537和2540）。结论:HCV在中国大陆具有遗传多样性,基因型和亚型内的重组可能是造成HCV遗传多样性的原因之一。选择压力分析结果表明大多数氨基酸位点处于负向选择状态,说明HCV变异主要是由于随机遗传漂移而积累的,而NS5B基因的氨基酸位点2537和2540处于正向选择状态,这可能对HCV复制和直接抗病毒药物（direct-acting antiviral agents,DAAs）的抗性有一定的影响。HCV的核心蛋白在免疫细胞中发挥重要抑制作用,核心抗原基因中两个氨基酸位点发生突变,可能是导致HCV慢性感染的部分原因。充分考虑变异、重组和选择压力对HCV遗传多样性和进化的影响,将有助于促进广谱抗病毒药物和疫苗的开发,也有助于建立一个适当的治疗性DAAs方案。第二部分 SV40病毒T抗原基因产生环状RNA的机制研究背景:环状RNA（circular RNA,circRNA）于上世纪九十年代被鉴定出,是一类重要的非编码RNA,可作为竞争性内源RNA吸附miRNA分子（miRNA sponge）,也可以与RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）相结合,发挥转录或转录后调控作用。但以上只是部分环状RNA的功能,大量环状RNA的功能仍未可知,需要进一步探索。在本课题组前期工作中,我们系统分析了 SV40病毒的circRNA表达谱,发现了 1个病毒来源的circRNA,将其命名为circ-17kT,但其具体形成机制和功能仍然未知。方法:SV40病毒感染Vero细胞后,利用核糖核酸酶R（Ribonuclease R,RNase R）抗性分析实验证明circl7-kT是环状RNA分子。首先我们利用剪接小体能识别RNA前体的剪接位点并催化剪接反应,以及5’剪接位点（5’splice site,5’SS）和3’剪接位点（3’splice site,3’SS）经典的剪接位点是可被剪接小体识别的RNA前体中内含子和外显子连接的接头位点这两个重要特征,利用用剪接小体抑制、剪接位点突变两个实验对RNA剪接过程相关原件在该环状RNA形成过程中的作用进行研究。其次,我们通过探究外显子及其两侧翼内含子的功能来研究circ-17kT形成机制。内含子在环状RNA形成过程中起到辅助作用,有的环状RNA形成过程中需要内含子的帮助。因此在预先确定第二个外显子（Exon 2）两侧内含子无重复和反向互补序列特征后,我们设计了第二个外显子（Exon 2）两侧翼内含子被截短的内含子截短实验。外显子跳跃是形成环状RNA的一种重要方式,因此我们设计了第一个外显子（Exon 1）到第三个外显子（Exon 3）的外显子跳跃实验。最后,采用质粒过表达和反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASO）干扰 circ-17kT 表达的策略研究 circ-17kT对其母本基因大T抗原（large T antigen,LT）基因的作用关系及其与病毒增殖能力的关系。结果:经RNase R消化证明circ-17kT是SV40病毒感染Vero细胞产生的环状RNA;当剪接小体被异银杏双黄酮抑制时,SV40病毒感染Vero细胞产生的circ-17kT表达量无明显变化;将5’剪接位点（5’splice site,5’SS）和3’剪接位点（3’splice site,3’SS）剪接位点进行突变后构建质粒转染细胞,转染后Vero细胞仍然能正常表达circ-17kT;内含子截短实验发现当形成circ-17kT的T基因Exon2两侧翼内含子发生截短时,circ-17kT形成没有影响;第一个外显子（Exon 1）到第三个外显子（Exon 3）的外显子跳跃实验表明circ-17kT可能不是由包含Exon 2的套索前体加工产生。过表达circ-17kT能正反馈促进SV40大T抗原基因mRNA的表达,但与对照组相比,SV40病毒滴度没有明显变化;而抑制circ-17kT表达时,LT表达显著下降且SV40病毒滴度显著降低。结论:circ-17kT形成过程中不需要由由剪接小体提供剪接功能,且circ-17kT形成过程中不需要形成套索前体,也不依赖于两侧翼内含子的帮助。初步实验表明circ-17kT不是由外显子跳跃驱动形成的。当剪接位点发生突变和Exon 2两侧翼内含子被截短不影响circ-17kT形成,提示circ-17kT形成存在其他由RBP或反式因子驱动的环化机制。初步功能分析显示,circ-17kT能正反馈促进其母本基因LT的表达,初步结果提示circ-17kT抑制表达时可抑制SV40病毒增殖。