低能离子诱导玉米Mu转座子激活及DNA甲基化表观遗传机制的研究

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:selene1988
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转座子是植物基因组的重要组成部分,对于研究植物基因组的组成、进化和基因的表达调控等都具有重要意义。植物转座子发掘、应用和活性调控机制的研究是近年来植物遗传育种和分子生物学研究热点之一。研究表明,植物在逆境胁迫条件下表观遗传变化是引起转座子活性变异的重要机制。通过对一些模式植物如拟南芥和水稻的研究,人们已经对植物在逆境胁迫条件下控制转座子活性的表观遗传现象已经有了初步的认识,但是对植物表观遗传调控转座子活性机理的研究还十分有限。本研究利用低能氮离子对含单拷贝Mu转座子系统的玉米花粉进行诱变,探索Mu转座子的转座特点和活性变异,并进一步分析Mu转座子的活性变异与其DNA甲基化表观遗传变化之间的关系。同时,利用生物信息学的方法对玉米RNA介导的DNA甲基化表观遗传调控途径的相关基因家族进行鉴定和表达分析,以揭示其在表观遗传调控中的作用。获得以下主要结果:1、通过低能N+离子注入单拷贝Mu转座子系统玉米花粉的研究发现,利用能量为30keV,注入剂量在2.43.6×1015ion/cm2之间的N+离子,能够有效地诱发玉米Mu转座子活性变异。通过遗传杂交获得了子代籽粒,并根据Mu转座子活性变异的指示性状,从子代籽粒中筛选出了两种具有明显表型特征变化的紫色斑点籽粒突变体。当注入剂量为2.4×1015ion/cm2N+离子时,从7296个子代籽粒中筛选出了12个密度较稀的斑点籽粒,表明Mu转座子被部分地激活(PA);当注入剂量为3.6×1015ion/cm2N+离子时,从5580个子代籽粒中筛选出了10个密度较浓的斑点籽粒,表明Mu转座子被完全地激活(FA)。2、通过Southern杂交、半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法检测了对照和突变体中非自主性的Mu1因子的转座特点和自主性的MuDR调控因子表达水平。结果表明,两种不同活性的Mu突变体中Mu1因子多态性明显地高于对照植株,分别产生了1.7kb和1.3kb特异性的Mu1限制性片段,表明Mu1因子发生不同程度的切离转座。半定量RT-PCR检测发现,不同生长发育时期和不同组织中与MuDR调控因子活性直接相关的mudrA和mudrB基因表现出差异性的表达水平。在突变体中,成熟的体细胞组织未表现出明显的mudrA和mudrB基因的表达水平上调现象;然而,在生殖组织中却表现出明显的mudrA和mudrB基因的表达水平上调现象,表明了MuDR调控因子的激活主要发生在配子形成期。实时荧光定量PCR检测进一步地显示,突变体成熟的花粉组织中mudrA和mudrB基因的表达量分别较对照提高了1.8~4.3倍和0.8~1.6倍,表明了MuDR调控因子在雄性配子中发生了明显的激活。3、通过限制性酶切和重亚硫酸盐测序相结合的方法,对玉米MuDR调控因子的TIRA和TIRB末端区域的DNA甲基化位点进行了定性和定量的检测。结果表明,在突变体MuDR调控因子的TIRA和TIRB末端,三种不同模式的胞嘧啶位点(CpG,CpHpG和CpHpH)均较对照植株都发生了不同程度的去甲基化变异。其中,对称的CpG和CpHpG胞嘧啶位点发生去甲基化变异较显著,分别较对照植株降低了35.3~55.9%和38.9~60.0%;而非对称的CpHpH胞嘧啶位点发生去甲基化变异较小,较对照植株降低了3.0~6.1%。此外,从单个的胞嘧啶位点甲基化变异情况分析发现,一些与MuDR的活性相关的重要位点,如32bp核苷酸组成的转座酶的结合位点(MBS),一个特征性的SacI酶切位点以及mudrA和mudrB基因的转录起始位点区域内所含的胞嘧啶位点均发生了不同程度的去甲基化变异,表明这些位点的去甲基化变异直接影响着MuDR调控因子的活性变化。4、通过生物信息学和半定量RT-PCR的方法鉴定与分析了5个编码DCL蛋白的基因(Zmdcl),18个编码AGO蛋白的基因(Zmago),5个编码RDR蛋白的基因(Zmrdr)以及8个编码DMT蛋白的基因(Zmet)及其表达情况。通过与拟南芥和水稻的同源基因的序列比较和进化关系分析表明,大部分基因的序列都是高度保守的,均具有其非常保守的功能基序和重要的功能结构域,预测其与拟南芥和水稻的同源基因编码蛋白具有类似的功能;系统进化树分析显示玉米、水稻和拟南芥中这些功能基因家族都进化成了四个不同的亚族,但在进化上玉米和水稻的同源基因比拟南芥具有更近的亲缘关系。同时,在两种非生物胁迫处理下,通过对这些基因家族的表达谱的分析显示,这些基因在不同的胁迫处理下表现出差异性的表达水平,预测这些基因家族的不同成员在RNA介导的DNA甲基化调控途径中可能具有不同的功能,为下一步对这些基因的克隆和功能验证提供了理论依据。
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