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目的:以年龄在20-50岁之间的健康同卵(Monozygotic,MZ)双胞胎、异卵(Dizygotic,DZ)双胞胎、非双胞胎(Non-twins,NT)为研究对象,分析MZ双胞胎、DZ双胞胎、NT三组之间外周血BCR-H假基因CDR3受体库(Pseudogene CDR3 repertoires)、框架外CDR3受体库(Out of frame rearrangement CDR3 repertoires)和功能性CDR3受体(Produtive CDR3 repertoires)库的同质性与异质性,以及BCR-H CDR3受体库前后5年之间的差异,初步探讨BCR-H CDR3受体库的形成机制,为进一步研究BCR的重排机制和应用提供基础。方法:1、采集健康双胞胎志愿者(D、e、F、G、h、i)外周血10ml,分离PBMCs(外周血单个核细胞)并提取DNA;设计并合成BCR-H CDR3受体库引物(7条含总IGHV家族上游引物,9条含功能基因和假基因IGHJ家族下游引物);然后以DNA为模板进行PCR扩增,胶回收PCR扩增产物送至华大基因,完成质检之后采用Illumina Solexa高通量技术进行测序。2、分别在2012年和2017年,采集健康双胞胎志愿者(A、B、c)外周血10ml,分离PBMCs并提取DNA;2012年样本DNA送至Adaptive Biotechnologies immune SEQ公司(美国华盛顿医院),2017年样本DNA送至华大基因,均采用PCR技术建立BCR-H CDR3受体库,并使用Illumina Solexa高通量技术进行测序(2012年的实验由课题组完成)。3、将9对健康双胞胎志愿者的DNA样本送至北京博奥晶典生物技术有限公司,采用PCR-SBT方法对HLA-A/B/C/DRB1位点进行分型检测。4、分析BCR-H CDR3受体库测序结果:(1)对比分析MZ双胞胎(D1/D2,F1/F2,G1/G2)、DZ双胞胎(e1/e2,h1/h2,i1/i2)和NT(D1/e1,D1/F1,D1/G1,D1/h1,D1/i1)假基因CDR3、框架外CDR3以及功能性CDR3受体库的同质性与异质性;(2)对比分析前后5年MZ双胞胎(A1/A2,B1/B2)、DZ双胞胎(c1/c2)和NT(A1/B1,A1/c1,A1/c2,B1/c1,B1/c2)BCR-H CDR3受体库的变化。结果:1、HLA分型检测显示:双胞胎A、B、D、F、G为同卵双胞胎,双胞胎c、e、h、i为异卵双胞胎。2、BCR-H CDR3受体库多样性分析:MZ双胞胎、DZ双胞胎、NT之间多样性无统计学差异(P>0.05);三组之间的高频率克隆(Highly expand clones,HEC)分析显示MZ双胞胎、DZ双胞胎均与NT存在统计学差异(MZ&NT:P=0.017;DZ&NT:P=0.01)。前后五年的BCR-H CDR3受体库多样性分析无统计学差异(P=0.116)。3、BCR-H CDR3受体库IGHV、IGHJ基因取用:在假基因、框架外和功能性CDR3受体库中IGHV取用有差异的基因家族均是双胞胎之间的差异最小;前后5年的变化也显示出MZ双胞胎之间最相似,尤其是在假基因CDR3受体库中。IGHJ取用在假基因CDR3受体库和框架外CDR3受体库中MZ双胞胎、DZ双胞胎、NT三组没有统计学差异(P>0.05),但在功能性CDR3受体库中IGHJ1家族取用频率表现出统计学差异(MZ&NT:P=0.007;DZ&NT:P=0.004)),并且双胞胎之间最相似;前后5年的变化在假基因CDR3受体库和框架外CDR3受体库中MZ双胞胎最相似,但是在功能性CDR3受体库中MZ双胞胎、DZ双胞胎、NT三组之间没有统计学差异(P>0.05)。4、BCR-H CDR3受体库氨基酸(Amino acid,AA)取用、AA长度分布和AA重叠分析:MZ双胞胎、DZ双胞胎和NT之间的AA取用、AA长度分布以及AA重叠均无统计学差异(P>0.05);前后5年的变化也无统计学差异(P>0.05)。5、BCR-H CDR3受体库核苷酸的插入与缺失:在功能性CDR3受体库中,相比于NT,MZ双胞胎之间和DZ双胞胎之间V(D)J连接处插入与缺失不同核苷酸数目的比例更为相似,前后5年的变化在MZ双胞胎、DZ双胞胎、NT三组之间无统计学差异(P>0.05);在假基因CDR3受体库和框架外CDR3受体库中这种相似性几乎没有,MZ双胞胎之间、DZ双胞胎之间、NT之间前后5年的变化存在不一致。结论:1、BCR-H假基因CDR3受体库IGHV取用,与NT(D1/e1,D1/F1,D1/G1,D1/h1,D1/i1)比较,MZ双胞胎(D1/D2,F1/F2,G1/G2)和DZ双胞胎(e1/e2,h1/h2,i1/i2)存在更多的同质性;前后5年IGHV取用相比于DZ双胞胎(c1/c2)之间和NT(A1/B1,A1/c1,A1/c2,B1/c1,B1/c2)之间,MZ双胞胎(A1/A2,B1/B2)之间的变化表现更一致。这提示V(D)J初始重排过程中IGHV取用有一定的遗传偏向性,这种偏向性可能影响个体外周的初始B细胞受体库的组成和特征,从而影响个体对外周抗原的免疫应答。2、在功能性CDR3受体库中AA取用、AA长度分布、AA重叠以及核苷酸的插入与缺失在MZ双胞胎(D1/D2,F1/F2,G1/G2)、DZ双胞胎(e1/e2,h1/h2,i1/i2)和NT(A1/B1,A1/c1,A1/c2,B1/c1,B1/c2)之间没有存在统计学差异;前后5年的AA取用、AA长度分布、AA重叠以及核苷酸的插入与缺失的变化在MZ双胞胎(A1/A2,B1/B2)、DZ双胞胎(c1/c2)和NT(A1/B1,A1/c1,A1/c2,B1/c1,B1/c2)之间无统计学差异。这提示遗传因素对BCR-H功能性CDR3受体库的AA取用、AA长度分布、AA重叠以及核苷酸的插入与缺失影响较小,长期的外界环境抗原刺激后,可能“稀释”了个体外周血总B细胞受体库的遗传偏向。