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目的:1.观察重组绿色荧光蛋白的卡介苗(rBCG)与人膀胱癌细胞株T24的直接作用部位,以及猪苓多糖(polyporus polysaccharide,PPS)对其的影响。2.研究猪苓多糖协同卡介苗(bacillus calmette guerin,BCG)对巨噬细胞J774的TLR4、辅助分子CD14表达的影响。3.研究卡介苗和猪苓多糖对小鼠巨噬细胞J774核转录因子NF-κB表达的影响。4.探讨猪苓多糖协同卡介苗对巨噬细胞表达分泌白介素-8、白介素-1β和肿瘤坏死因α的影响,研究其参与免疫启动的过程。 方法:1.将rBCG表达的绿色荧光蛋白作为报告基因,用激光共聚焦显微镜观察rBCG以及PPS协同rBCG培养的T24细胞的变化,并辅以流式细胞仪协助分析。2.用直接荧光法对BCG、PPS共培养后的J774细胞进行标记,利用流式细胞技术,观察TLR4以及其辅助分子CD14的表达情况。3.而后用间接荧光法对BCG、PPS共培养后的J774细胞进行染色,利用激光共聚焦显微镜技术,观察核转录因子NF-κB分子,在胞浆和胞核表达的变化以及其转移的情况。4.将BCG或BCG加PPS作用于体外培养的小鼠巨噬细胞J774,运用ELISA技术,检测巨噬细胞上清液中IL-8、IL-1β和TNF-α的含量。 结果:1.(1) 激光共聚焦显微镜扫描的图像显示:T24细胞与rBCG相互作用24h以后,在细胞浆中发现明显的绿色荧光(86.335±5.856)。同时用流式细胞仪检测rBCG组24、48h的T24细胞,发现其SS&FS为参数的散点图上,较对照组其SS、FS的散射光信号均增强,T24细胞群向右上方偏移;同时在FL1通道检测到GFP+T24细胞(8.7±1.572)%、(13.8±2.31)%的存在(P<0.05)。(2) 随后对rBCG和rBCG联合PPS两用药组进行比较,发现当两组药物都分别作用超过24h后,rBCG联合PPS用药组T24细胞细胞核内绿色荧光(72.603±1.165)增强,细胞浆荧光(93.06±0.958)减弱,核/浆荧光强度比(0.78±0.005)明显增大,经统计学分析,与rBCG组(62.832±2.909,105.306±6.393,0.597±0.012)相比,差别有统计学意义(P<0.05)。 2.(1) 猪苓多糖协同卡介苗对J774细胞表达CD14的影响:BCG(50ug/ml)组24h,J774细胞上CD14的表达升高,BCG+PPS组的CD14的表达都明显高于BCG组(P<0.05)。J774细胞表面CD14的表达在6h出现峰值,随后缓慢下降。(2) 猪苓多糖协同卡介苗对J774细胞表达TLR4的影响:BCG(50ug/ml)组作用J774细胞0.5h、12h、24h及48h,其TLR4的表达明显升高(P<0.05);协同PPS作用0.5h、1h、3h、6h及24h,J774细胞TLR4的表达明显高于BCG组(P<0.05)。BCG(250ug/ml)组作用J774 0.5h、3h、6h及48h,其TLR4的表达明显升高(P<0.05);协同PPS作用1h,J774细胞TLR4的表达高于BCG组,作用24h,其TLR4的表达明显升高(P<0.05)。J774细胞TLR4的表达在3 h出现谷值,随后在6 h表达出现峰值,之后迅速下降,在24 h-48 h缓慢上升。