miR-210靶基因筛选及其在三阴性乳腺癌中的作用机制研究

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gexuefeng1
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目的:前期研究已经通过靶基因预测软件得出乳腺癌中miR-210可能的靶基因:MEF2A、EGR3、SETD2、E2F3、CHAD、AIFM3、HMGB1。本研究主要是通过定量PCR和蛋白印迹实验(Western blot)对这七个预测基因进一步的验证。初步分析预测基因在乳腺癌中的作用机制,为乳腺癌的诊断和治疗提供新的靶点。方法:1.采用lipofectamineTM2000把miRNA-210mimic及miRNA-NC。 miR-210inhibitor及niR-210-INC转染入人乳腺癌细胞MDA-MB-231中,通过倒置荧光显微镜检测miR-210的转染效率;real-time PCR法检测转染后第24h、48h、72h miR-210的表达水平;转染后的细胞用TROZIO法提取细胞的总RNA,紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量,并反转为cDNA备用;通过定量PCR技术对基因进行扩增,用2-ΔΔct的方法计算出七个基因的表达情况。2.Western blot对人乳腺癌细胞中miR-210靶基因的蛋白水平检测。结果:1.miRNA-210mimics及miRNA-NC、miR-21Oinhibitoi·及niR-210INC成功转染入MDA-MB-231细胞,转染效率达(87.31±2.68)%;2.转染miR-210inhibitor后48h,miR-210表达水平降至最低,抑制效果最好;3.紫外分光光度计检测总RNA的吸光度值(A260/A280)=1.8~2.0,浓度为300~700ng/μm,琼脂糖凝胶电泳显示较为清晰的28s、18s和较淡的5s带,质量较好,可用于下一步的实验;4.定量PCR结果显示MEF2A、EGR3、SETD2、AIFM3、CHAD、HMGB1基因表达量无统计学意义,EGR3基因表达量有统计学意义;5. Western blot显示E2F3蛋白条带转染miR-210inhibitor后加深,转染niRNA-210mimics后变淡。结论:MEF2A、EGR3、SETD2、CHAD、HMGB1、AIFM3不是乳腺癌miR-210的靶基因,EGR3可能是其靶基因。研究有助于对乳腺癌的分子机制有更加全面的了解,并且可以为乳腺癌的诊断和治疗开辟新的治疗方法。
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