研究背景和目的：脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是一类高致残的中枢神经系统(central nervous system, CNS)疾病。据估计,全球有250余万脊髓损伤患者,每年新发患者超过13万,且多发于青壮年。随着现代医学的发展,SCI后患者的存活率明显上升,但遗留的后遗症严重影响患者生活质量,降低生命预期,给家庭和社会带来沉重的负担。为治疗SCI人们进行了许多探索,但至今,效果并不理想。随着干细胞领域研究的不断深入,发现干细胞能分化为多个胚层的组织细胞,替代损伤等所带来的细胞缺失,同时能分泌多种营养因子,改善损伤局部的微环境,促进损伤的修复,使得细胞移植治疗成为治疗CNS等系统疾病的一种极具前景的方法。多年来,不同种类的干细胞被研究用于治疗多系统的不同疾病,取得了不同的疗效,但随着研究的深入,干细胞治疗也因伦理问题、增殖分化能力、有成瘤致畸等风险而备受争议。近年,随着研究的深入,人们发现间充质干细胞(mesenchymal stromal cell, MSC)无伦理等相关问题、在体内外有很强的增殖分化能力、同时具有较低的免疫源性,成为细胞移植治疗的理想来源。其中脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADSCs),由于相较于骨髓来源及脐带等来源的MSC,有更强的分化能力,更低的免疫源性,更广的来源,目前被认为是细胞移植治疗SCI的上佳来源。有研究证实,将ADSCs移植治疗SCI相较于骨髓等来源的MSC对减轻损伤,促进损伤后运动、感觉等功能的恢复具有更明显的效果。近来,临床及基础研究证实运动训练对于SCI后运动、感觉等功能的恢复有促进作用和可喜的应用前景。运动训练能提高损伤脊髓组织的可塑性,改善损伤后局部的血液供应,减轻炎症反应、细胞的凋亡,促进中枢神经系统神经营养因子等的表达,促进内源性神经干细胞的迁移分化,对功能的恢复有至关重要的作用。同时相关研究也已证实运动训练还能提高移植细胞的存活能力,对治疗有进一步强化促进作用。随着对SCI后病理生理研究的不断深入,发现SCI后全身及脊髓局部会发生极其复杂的病理生理改变包括神经细胞的凋亡、组织的缺血水肿、炎症细胞的浸润、轴突的断裂、髓鞘的溶解等,且其持续时间根据原发性损伤程度的不同从数月到数年不等。正是由于这种伤后复杂且持续的病理生理变化,使得目前各种单一治疗(细胞移植、运动训练、药物治疗等)的效果十分有限,为此,有研究开始从多方面着手,采取联合治疗来进一步提高治疗效果。相关研究已证实,联合治疗相较于单一治疗能明显改善伤后运动、感觉等功能的恢复。鉴于运动训练能改善脊髓组织的可塑性及局部微环境,促进CNS中营养因子等的表达,提高移植细胞的存活与分化能力；ADSCs移植后能在局部存活、减轻伤后炎症反应、减少细胞的凋亡、减轻胶质瘢痕的生成、促进神经轴突的再生,且目前两者单一治疗对脊髓损伤后神经功能的恢复作用十分有限,我们选择采用联合两者来治疗不完全脊髓损伤,探讨此联合治疗是否能进一步促进伤后运动功能的恢复及相关机制,为临床治疗SCI提供理论依据。方法：1、人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的收集、提取、培养及细胞流式鉴定细胞表面标志、细胞周期检测；荧光双标法检测间充质干细胞相关蛋白：波形蛋白(vimentin)、层粘连蛋白(laminin)、纤连蛋白(fibronetin);采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞体外分泌脑源性神经营养因子(BDNF)的能力。2、采用改良的Allen法制作T10不完全脊髓损伤模型,将造模成功的SD大鼠进行分组：联合治疗组、细胞移植组、运动训练组、损伤对照组,以及假手术(只打开椎板,不造成脊髓损伤)。细胞移植组及联合治疗组即刻用Hanmihon微量注射器将鉴定过的浓度为2×105个/μL的101μL细胞沿损伤中心头尾端缓慢注入；运动训练组、损伤对照组及假手术组用同样方法移植等量PBS；联合治疗组及运动训练组在伤后24小时开始行每天30min、每次15min、间隔5min、每周5次的,持续到实验结束的运动训练(跑台训练)。3、行为学评定：在术前和术后第1、2、3、7、14、21、28天采用Basso, Beattie and Bresnahan(BBB)法对各组大鼠后肢运动功能进行双盲评分。4、脊髓组织冰冻切片免疫荧光法检测不同时间点、不同组别的脊髓组织中炎症反应(ED1+)、损伤空洞面积(胶质瘢痕面积,GFAP+).轴突(神经丝蛋白(NF-200)、血清素(5-HT))以及用抗人核(anti-human nuclei antibody,hNU)检测细胞存活的情况。5、提取新鲜脊髓蛋白,采用二辛可宁酸(BCA)法检测脊髓总蛋白含量,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测相同标本的BDNF含量,然后测得不同组别间、不同时间点脊髓组织中BDNF蛋白的相对表达量。结果：1、细胞的生长、形态、鉴定以及体外分泌能力：原代hADSCs接种后约2-4小时即开始贴壁,贴壁细胞呈圆形,24小时后可见小胞质突起；72小时首次换液弃掉未贴壁细胞后,可见贴壁细胞大量增殖,其形态也多趋向于成纤维样细胞,胞质丰富,细胞呈平行排列生长或漩涡状生长。一般原代细胞培养7天左右即能达到80%一90%融,此时用0.25%胰蛋白酶消化传代。传代后的细胞生长旺盛,约3天后可再次传代,且形态愈趋向长梭形。hADSCS的表面标志鉴定:高表达间充质表面标志CD44.CD90.CD29.CD105；干细胞表面标志：CD13；低表达造血干细胞和内皮细胞表面标志CD34、CD45、CDllb、HLA-DR,阳性率都在0-1%。细胞周期检测显示：84.86%的细胞都处于G1期、6.41%处于G2期、6.73%处于S期,细胞凋亡比率为0.09%,说明细胞活力很好,有很强的增殖分化能力。细胞阳性表达间充质干细胞相关蛋白：波形蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白。ELISA检测证实hADSCs在体外有分泌BDNF的能力。2、所有大鼠术前的BBB评分均为21分,术后除假手术组外,各组大鼠均呈现迟缓性瘫痪,得分在0-1分左右；随着时间的推移,大鼠运动功能出现不同程度的恢复,其中联合治疗组在各时间点的得分都显著高于其它各组(P<0.05),第28天时,均可以达到14.7±0.44分(基本能完成持续协调的足底负重步行)；细胞移植组和运动训练组也明显高于损伤对照组(P<0.05),但两组之间并无显著性差异(P>0.05),第28天时,平均达到12.0±0.05分(基本能完成频繁的足底负重步行,协调程度十分有限)；而损伤对照组在第28天时为8.33±0.50分(基本不能完成足底负重步行,呈拖行步态)。3、移植细胞存活率、炎症反应(ED1+)、空洞面积(GFAP+)、轴突数量(NF-200+、5-HT+):SCI后移植到体内的细胞能持续存活。术后第7、14、28天,在细胞移植组和联合治疗组损伤中心头尾端都发现有数量不等的存活的hADSCs沿着损伤中心分布,在7、14天时,联合治疗组存活细胞量都明显高于细胞移植组(P<0.05),到第28天时,两组之间的细胞存活量已无明显差别(P>0.05)。炎症反应(ED1+)及空洞面积(GFAP+)：SCI后脊髓局部会出现明显的炎症反应,且胶质瘢痕反应明显。但是不管是何种干预治疗都会明显减轻炎症反应及空洞面积。各组在术后7天都有十分明显的炎症反应,随着时间的推移炎症反应逐渐减轻,但不管是第7天还是28天,联合治疗组的炎症反应相较于其它组都明显减轻(P<0.05),同时细胞移植组和运动训练组相较于损伤对照组也明显减轻(P<0.05),但两组间无明显差别(P>0.05)；在第28天时,联合治疗组的GFAP+面积最小,然后是细胞移植组和运动训练组,最后是损伤对照组(P<0.05)。轴突数量：SCI后损伤中心的神经纤维(NF-200)大量断裂缺失,腰膨大处的5-HT明显减少。3种干预治疗都会在不同程度上减轻神经纤维的断裂及减少,在术后第28天,联合治疗组的阳性比例最高,有更多的神经纤维通过损伤部位,以及在腰膨大处有更多再生的5-HT(P<0.05),次之是运动训练组,然后是细胞移植组,最后是损伤对照组。4、脊髓BDNF蛋白的相对表达量：术后各时间点,假手术组BDNF的相对表达量都很稳定,无明显差异(p>0.05)。不管是细胞移植、运动训练还是联合治疗都能减轻SCI所带来的BDNF表达的下降,并能短时间的促进其表达。损伤对照组术后随着时间的推移,BDNF的相对表达量持续下降,到术后28天时已明显低于术后第3天时(P<0.05)；而给予干预处理的3组,其表达量在术后第7、14、28天都明显高于损伤对照组(P<0.05),其中联合治疗组最明显(P<0.05),其在术后第7、14天的相对表达量都明显高于其它各组(P<0.05)。结论：运动训练联合hADSCs移植治疗对不完全脊髓损伤大鼠运动功能的恢复具有协同作用,其机制与进一步促进BDNF的分泌,减轻伤后炎症反应,减少损伤面积,促进轴突的再生有关。