前言早产儿慢性肺疾病（chronic lung disease,CLD）是早产儿长时间吸入高浓度氧或机械通气治疗后的最常见和最严重的并发症。近年来,随着低出生体重儿存活率的不断提高,其发病率呈上升趋势,其中的10—15%的患儿于生后一年内死于呼吸衰竭,存活者也需长期（数月或数年）依赖氧气或机械通气治疗。CLD的最终结局为肺间质纤维化,使其肺功能受损,严重影响了患儿的生存质量。因此探索早产儿CLD肺纤维化的发生机制成为当今新生儿领域亟待解决问题。现研究认为,高浓度氧对未成熟肺的危害性是CLD发生的最主要原因,并且通过应用单纯吸入高浓度氧制备CLD动物模型已得到证实。肺组织细胞内抗氧化酶（antioxidant,AOE）系统,包括超氧化物岐化酶（SOD）,过氧化氢酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等缺乏是早产动物发生肺损伤的原因之一。此外,感染、早产、动脉导管未闭、高压力的机械通气等也与CLD的发生有关。目前有关早产儿CLD发生机制的研究多集中于细胞因子,如高水平的TNF-α表达可以引发慢性炎症反应而导致CLD的发生,低水平的TNF-α可降低CLD发生的危险性和严重性。有学者发现,脐带血中高水平的IL-6、IL-8和TNF-α,预示着患儿最终发生CLD的可能。另外还有许多细胞因子如IL-4、IL-10、TGF-βI、CTGF、VEGF等细胞因子发挥抗炎、促纤维化及调节新生血管形成的作用。目前,在众多的细胞因子中,转化生长因子-β（transforming growth factor,TGF-β）和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的作用备受关注,成为纤维化研究的热点因子。TGF-β是一种多功能细胞因子,在肺的发育和维持肺的稳态中发挥重要作用,然而很多研究也证实了该因子与器官纤维化的发生密切相关,如我们在前期研究,也发现TGF-β1基因及蛋白过度表达与CLD肺纤维化的发生密切相关。但有学者试图通过阻断TGF—β的作用以达到抗纤维化的目的,然而TGF—β生物学作用复杂,如果完全阻断其表达,其它的生物学作用也将受到影响。因此,寻找其下游更具特异性的促纤维化的细胞因子,可能是探索早产儿CLD有效防治途径的重要突破口。结缔组织生长因子（CTGF）属于即刻早期基因家族的成员,其蛋白是富含半胱氨酸、38KDa的分泌肽,它是成纤维细胞的分裂剂和胶原沉积的促进者,越来越多的研究表明了它在纤维化疾病中的重要作用,然而有关CTGF在早产儿CLD肺纤维化发生中作用,目前尚不清楚。因此,本研究基于我们前期的研究结果（虽TGF-β1过度表达与CLD肺纤维化有关,但机制尚不清楚）,在建立高氧致早产鼠CLD模型的基础上,应用体外培养的肺成纤维细胞,通过RT-PCR等技术,试图阐明肺组织TGF-β1异常分泌,使其下游因子CTGF基因过度表达,是高氧致CLD肺纤维化发生的原因之一。材料与方法一、动物实验（一）实验分组及动物模型的制备将孕21天的大鼠行剖腹产取出仔鼠,即为早产鼠,将早产鼠生后即随机分为两组,即实验组（高氧组）和对照组（空气组）,每组均为50只。实验组将早产的WISTAR大鼠生后即置于氧箱中,持续输入氧气,维持氧浓度为0.90,用钠石灰吸收CO₂,使其浓度小于0.5%,温度为25—27℃,湿度50%—70%,每天开箱0.5小时,添加水及饲料,更换垫料,并每天与空气对照组互换代母鼠以避免因氧中毒而致护理能力降低;对照组置于空气中（氧浓度21%）,具体方法及控制因素同空气组。（二）标本的采集和处理于实验后1、3、7、14、21天分别从两组中随机抽取10只,用10%的水合氯醛麻醉后立即打开胸腔,分离肺组织。将左肺置于4%的多聚甲醛中固定,用于HE染色和免疫组化检测。二、体外实验（一）肺成纤维细胞的培养及鉴定将孕19天的wistar大鼠麻醉后剖腹取出胎鼠,将胎鼠用10%水合氯醛麻醉致死,用75%的酒精浸泡后,迅速打开胸腔,取出肺组织,分离胎鼠肺成纤维细胞。将分离成功的肺成纤维细胞进行培养、传代,于第3代细胞进行波形蛋白免疫组化技术进行成纤维细胞的鉴定,同时进行TGF-β1对肺成纤维细胞的干预实验。（二）TGF-β1的刺激试验当传代细胞（第三代）至细胞融合达70%左右时,更换为无血清培养液,48小时后进行分组实验。在21%氧浓度条件下,分别用0ng/ml（加入等量的无血清培养液）、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的TGF-β1作用于早生鼠肺成纤维细胞,于24小时收集细胞,于—80℃冰箱中保存;用10 ng/ml的剂量分别于12、24、48小时收集细胞,于—80℃冰箱中保存,同时于12、24、48小时设立空白对照组。（三）标本的采集于24小时收集0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激下的成纤维细胞。于12、24、48小时收集10 ng/ml TGF-β1刺激下的成纤维细胞,及对应时间点的空白对照组细胞。三、实验方法及检测指标（一）肺组织形态学研究1、光镜下观察肺组织形态,研究高氧致早产鼠CLD肺的病理学改变。2、采用Ashcroft等人的方法进行纤维化评分,判定肺纤维化的程度（二）肺组织免疫组织化学技术检测肺组织CTGF蛋白表达于每个时间点随机抽取染色清晰的切片10张,每张切片于光镜下（×400）随机选取5个视野,固定窗口面积,以胞浆只中有棕黄色颗粒为阳性细胞,其蛋白的定量测定利用美国Universal Imagining Porppration图象分析系统,应用MetaMorph软件测定平均积分光密度值,用来表示CTGF表达的强度。（三）波形蛋白免疫细胞化学技术（成纤维细胞鉴定）收集早产鼠肺成纤维细胞,用SABC法对成纤维细胞中的波形蛋白进行染色,光镜下观察、鉴定成纤维细胞。（四）RT-PCR检测肺成纤维细胞CTGFmRNA的表达对收集的肺成纤维细胞用RT-PCR方法进行基因序列扩增,对扩增产物进行分析:扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外灯光下观察并拍照,用Kodak1D型凝胶成像系统及分析系统进行电泳条带分析。用CTGF与β—actin扩增产物的吸光度比值来表达每个标本的相对mRNA水平。三、统计学分析采用SPSS11.5统计学软件进行分析,所有数据均以平均值±标准差（（?）±s）表示,两样本方差齐性检验应用F检验,根据样本的方差齐性检验F值,两组间比较分别应用t检验或t′检验,相关性分析采用spearman分析;多个组间比较采用ANOVA分析,以P＜0.05表示差异有显著性。结果一、肺组织形态学改变生后1天两组均表现为肺泡间隔较厚,肺泡样结构不规则;3天时空气组肺泡间隔变薄,肺泡结构渐规整,大小较均匀,高氧组肺泡间隔有少许炎性细胞渗出,肺泡腔内有少许红细胞渗出;7—21天空气组肺泡间隔变薄,肺泡结构逐渐规整,;高氧组7天时,可见肺水肿,间质细胞增多,炎性细胞浸润等;14天时,肺间质成纤维细胞增加,肺泡间隔明显增厚,肺纤维化逐渐形成;21天时,肺泡间隔增宽,肺间质细胞明显增多,肺泡正常结构消失,肺纤维化形成。二、肺组织纤维化评分与对照组相比,14d、21d时实验组肺纤维化评分有统计学差异,P＜0.05。三、肺组织CTGF蛋白的表达（一）CTGF表达部位空气组CTGF在血管内皮细胞,支气管和细支气管上皮细胞有微弱表达。高氧组1、3天表达与对照组相似,7天时可见肺上皮细胞、成纤维细胞表达微弱的CTGF;14天时,在肺上皮细胞和间质成纤维细胞中表达均明显增强;21天时,CTGF在这些细胞中的表达进一步增强,肺成纤维细胞为其主要表达细胞。（二）CTGF蛋白表达强度检测实验开始后1、3、7天实验组和对照组肺组织CTGF表达强度无显著差异（P＞0.05）,14天实验组和对照组分别为:11.23±2.11,5.42±0.59,P＜0.01;21天分别为:15.91±3.02,5.86±0.73,P＜0.01。四、相关性分析采用spearman方法进行相关性分析:高氧暴露下早产鼠肺组织CTGF表达与纤维化评分呈明显正相关:r=0.892,P＜0.01。五、成纤维细胞鉴定光镜下观察,可见成纤维细胞细胞浆被染成棕黄色（×200）,胞浆中有呈丝状的波形蛋白。六、TGF—β1刺激下早产鼠肺成纤维细胞CTGFmRNA的表达在0 ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10 ng/ml TGF—β1刺激下,肺成纤维细胞24小时CTGFmRNA的表达分别为0.26±0.02,0.29±0.03,0.62±0.09,0.88±0.02,与0 ng/ml组进行比较,5ng/ml、10 ng/ml组p值均＜0.05,而1 ng/ml组p＞0.05,对1 ng/ml、5ng/ml、10 ng/ml TGF—β1刺激下24小时CTGFmRNA的表达进行组间比较,p值均＜0.05。分别用10 ng/ml、0 ng/ml TGF—β1对肺成纤维细胞进行刺激,分别于12,24,48小时测定CTGF mRNA的表达,12小时10 ng/ml、0 ng/ml TGF—β1刺激下,CTGF mRNA的表达分别为:0.31±0.02,0.17±0.01,P＜0.05;24小时分别为0.79±0.04,0.19±0.03,P＜0.05;48小时分别为0.96±0.03,0.20±0.02,P＜0.05,且对10 ng/ml刺激下12、24、48小时CTGF mRNA的表达进行两两比较,P值均＜0.05。结论1、暴露高氧中早产鼠,其肺组织CTGF蛋白的高水平表达与肺纤维化的程度密切相关。2、通过TGF—β1刺激肺成纤维细胞CTGF基因表达的体外实验,表明CTGF可能是TGF—β1诱导早产鼠纤维化发生的下游因子之一。