被子植物的生活史是一个世代交替的过程,二倍型的孢子体世代经由减数分裂进入单倍型的配子体世代,产生雄配子和雌配子;随后,二者经历双受精形成胚胎和胚乳,进入新一轮的孢子体世代。雄配子体及雄配子发育是一个严密而复杂的过程,包含一系列精准调控的结构和分子变化,需要大量花药孢子体组织与配子体组织基因的有序表达,为理解细胞命运特化,细胞信号转导和细胞极性建立提供了一个极佳的模式。雄配子体成熟之后,经由传粉及花粉管生长,其所携带的两个精细胞被送入胚囊并与卵细胞和中央细胞融合完成双受精,启动胚胎发生和胚乳发育。双子叶模式植物拟南芥的合子通过规律而固定模式的细胞分裂与分化形成具有鲜明顶基轴向和辐射轴向的胚胎,这一过程已有广泛而深入的研究。相比而言,单子叶模式植物水稻胚胎的细胞分裂似乎随意而无章法,且在分化过程中不仅有顶基轴向与辐射轴向的形成,而且有独特的背腹轴向的建立。此外,与拟南芥截然不同的是,水稻胚乳细胞分化为淀粉胚乳和糊粉层,且水稻糊粉层亦有背腹差异。相对拟南芥而言,水稻配子体发育和种子发育过程的研究仍显薄弱,尤其对于雄性败育过程中雄配子体营养生长和其内部所发生的诸如核迁移,液泡动态变化等细胞学事件及其中所牵涉的调控机制依然知之甚少。另一方面,水稻等单子叶植物胚胎发生过程中背腹模式建成与胚乳糊粉层背腹轴向分化所涉及的分子调控机理仍不甚了解;此外,决定早期胚乳游离核定位的因素同样鲜为人知,这些问题均亟待进一步深入研究与了解。本研究以模式植物水稻为实验对象,通过CRISPR/Cas9技术获得Osgcd1/+突变体,基于OsGCD1蛋白的亚细胞定位和表达模式分析,详实地观察了Osgcd1突变雄配子体的发育过程,试图解释液泡动态变化及核迁移与功能雄配子体发育之间的关系。同时,借助WECLSM技术、原位杂交技术、TUNEL技术等研究手段探讨了 OsGCD1突变对于水稻早期胚胎发生及模式建成,胚乳游离核定位,反足细胞适时降解,胚乳细胞化及糊粉层分化等方面的影响,希望在一定程度上揭示植物胚胎背腹模式建成,胚乳游离核定向分布与糊粉层背腹轴向分化的分子机制。现将主要实验结果概括如下:1.通过生物信息学分析,我们于水稻基因组中筛选得到OsGCD1基因,其编码一个定位于线粒体,由345个氨基酸组成的蛋白质,且与拟南芥GCD1高度同源。荧光定量PCR结果表明,OsGCD1在根、茎、叶等营养组织,花药,成熟子房以及授粉后1天至10天的种子中广泛表达。另外,RNA原位杂交结果显示花药中OsGCD1主要在绒毡层和小孢子中表达,成熟子房中OsGCD1主要在胚囊中表达;在发育的种子中,OsGCD1的表达伴随了整个胚胎发生和胚乳发育。综上可推测,OsGCD1可能在雄配子体形成,胚胎发生和胚乳发育中发挥重要作用。2.我们在OsGCD1基因的第一个外显子且靠近ATG起始密码子处选择3个特异位点,运用CRISPR/Cas9技术对这些位点进行编辑并成功获得突变体。株系筛选过程中我们无法取得OsGCDl的纯合突变体。进一步的正反交实验表明,纯合突变的缺失是由于Osgcdl突变无法经由父本遗传。因此,我们以Osgcd1/+为材料进行OsGCD1基因的功能分析。初步结果表明Osgcd1/+的营养生长未有显著异常,但花粉育性与结实率有一定程度的降低。3.针对Osgcd1/+花药与雄配子体发育过程的详细研究表明,OsGCD1参与调控雄配子体发育。我们发现Osgcd1/+具有正常发育的花药壁层,但Osgcd1突变导致雄配子体发育延迟,且影响花粉萌发,表明雄配子体发育异常是由自身功能缺陷所造成的,而非取决于绒毡层的发育。进一步观察表明,Osgcd1雄配子体的中央液泡宿存而未正常解体消失,同时该现象伴随着花粉内含物积累减少,花粉内壁变薄等表型,这暗示了异常的雄配子体后期营养发育直接影响雄配子体功能的实现。但与此同时,精细胞形成并未受雄配子体异常发育的影响,但生殖细胞与精细胞的迁移路线和最终定位发生了改变。4.基于Osgcd1什胚胎发生过程的研究结果,我们发现OsGCD1突变影响水稻胚胎模式建成。OsGCD1突变未对卵细胞发育造成显著影响,其在受精之后可以启动胚胎发生,这显然与拟南芥GCD1突变体不同。随后的胚胎发育则表现出明显异常。Osgcd1/+的异常胚胎发育迟缓,严重者甚至提前终止发育。在胚胎分化阶段,异常胚胎的轴向,尤其是背腹轴向的形成受到严重干扰。另一方面,GE、OSH1、OsMPK6等胚胎发育相关基因的定量数据证明,OsGCD1突变影响了胚胎模式建成以及组织分化。整体原位杂交结果也显示了,原本在胚胎背侧盾片表皮表达的GE基因在异常胚胎的背腹两侧均有表达,而理应在腹侧SAM及其周围区域表达的OSH1基因在异常胚胎中的表达区域缩小,该结果与之前的形态学观察吻合。简言之,OsGCD1突变影响了胚胎模式建成,尤其是背腹轴向的分化。5.OsGCD1在水稻胚乳发育中发挥关键作用。野生型中胚乳游离核沿着子房腔室内部均匀分布,而Osgcd1/+异常子房中,胚乳游离核仅局限分布于珠孔端,这表明OsGCD1参与早期胚乳游离核的定位。随后,野生型胚乳由外至内逐层细胞化,且细胞之间的界限清晰而规整。相反,Osgcd1/+突变体的胚乳细胞化则显得杂乱无章。我们应用TUNEL技术分析了细胞化胚乳的PCD状况,结果表明在野生型胚乳细胞完全细胞化之后,在即将分化为淀粉胚乳的区域,胚乳细胞会启动PCD,致使细胞轮廓逐渐模糊;而突变体中细胞化的胚乳未能及时启动PCD,这可能是造成胚乳垩白的原因。此外,突变体糊粉层分化亦受到影响,表现为糊粉层细胞层数增加和背腹轴向分化异常。6.水稻胚囊在形成7胞8核结构之后,反足细胞仍继续增殖并形成反足细胞团。我们的实验结果表明,野生型中反足细胞团将宿存至胚乳游离核起始细胞化之后方才降解。然而Osgcd1/+突变体中由于胚乳细胞化延迟,继而导致反足细胞降解亦相应推迟。此外,Osgcd1/+胚乳游离核被局限在珠孔端至反足细胞团之间的区域。这暗示着反足细胞适时降解有赖于特定阶段的胚乳发育,同时反足细胞可能参与调控胚乳游离核的定向分布。综上所述,OsGCD1编码线粒体蛋白,在有性生殖过程中广泛表达。Osgcd1突变无法经由父本遗传而且降低母本遗传率。OsGCD1通过影响液泡动态变化,细胞核迁移和营养生长来调控雄配子体发育及其功能实现。OscGCD1突变未明显改变卵细胞形态发育,但随后的胚胎模式建成,尤其是背腹轴向分化受到显著干扰。此外,OsGCD1参与早期胚乳游离核定位及随后的胚乳细胞化和糊粉层背腹轴向分化。同时,反足细胞的适时降解与早期胚乳发育之间可能存在一定的协同作用。本研究证明了有序的液泡动态变化是雄配子体发育所必需的,而雄配子体后期发育与雄配子形成是两个相对独立的过程;为植物胚胎背腹模式建成,胚乳游离核定向分布以及糊粉层背腹轴向分化提供了新的认识。