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目的:mgrA基因位于金黄色葡萄球菌染色体中,包含444个碱基对,编码147个氨基酸的mgrA蛋白。获取mgrA基因是表达MgrA蛋白的前提,为进一步构建载体研究其在细胞中表达做准备。现拟运用分子生物学方法,从金黄色葡萄球菌全基因组中提取mgrA基因,经PCR方法克隆得到的mgrA基因。研究mgrA基因的功能,关键是其表达于感受态细胞中,完成表达载体的构建,而所有问题的前提是获取该目的基因。为了大量制备MgrA,以及探讨MgrA的生物学活性,和实现大规模获得mgrA创造前提条件,本研究旨在利用基因工程手段,本着追踪、创新的原则,探索一个切实可行、经济有效的纯化、生产重组的方案,为广泛开展重组mgrA的应用研究及工业化生产莫定基础。方法:采用PCR扩增mgrA基因,并进行DNA序列分析;将测序正确的目的基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-A;重组pRSET-A转化入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用层析方法对表达蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE及Western-blot检测。结果:在设计引物的引导下,应用美国Ambion公司在线设计工具,http://www.ambion.com,根据N315全基因序列,设计20nt的特异性引物。按照优化原则,选择起始密码子100nt后,基因编码区中以CC开头长度为20个碱基,G/C含量在30%～52%之间,无内部重复序列。PCR法扩增出mgrA的基因的序列,PCR产物经1%琼脂糖电泳,得到与预期结果大小相符(444bp),且无非特异性产物。重组载体在HindⅢ和BamHⅠ酶切后经PAGE电泳分析,得到444bp大小的条带,初步证明合成片断成功插入表达载体。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶切产物进行鉴定。随后能过DNA序列测定证实所插入的片断序列与合成序列符合,说明我们已成功构建了针对mgrA基因的pRSET-A表达载体,为进一步评价pRSET-A载体对mgrA基因表达影响提供了可能。经亲和层析获得表达后的重组蛋白。经聚丙烯酰胺凝胶电泳法证实获得初步纯化的MgrA。经SDS-PAGE及基因测序和同源性分析表明,工程菌经IPTG诱导后,在相对分子量约19.2kp处出现了一条明显的新蛋白带,其大小与理论推算的蛋白分子量相符合。并检测对比两者辉度值,经统计学t检验和方差分析,两者具有统计学意义。此外发现,诱导后1h该蛋白即开始表达,3-4h达高峰。初步纯化的产物经离子交换层析,获得多个蛋白洗脱峰,经聚丙烯酰胺凝胶电泳法证实获得纯化的重组MgrA蛋白,凝胶回收MgrA蛋白纯化前夹杂较多菌体蛋白,将从凝胶回收的目的蛋白,再进行SDS-PAGE,得到的蛋白条带纯度高。从克隆得到长444bp的mgrA基因,测序正确;经EcoRI和HIND1酶切鉴定证实,mgrA成功地克隆到表达载体pRSET-A:构建的表达载体pRSET-A在太肠杆菌中表达出相对分子量为24kD的融合蛋白,经常压离子交换色谱纯化后的融合蛋白的纯度达到90%。成功地克隆并表达了mgrA基因,并对其进行了初步纯化,为大规模获得mgrA创造了条件。结论:本研究旨在利用基因工程手段,成功地克隆并表达了mgrA基因,并对融合蛋白进行了初步纯化,为大规模获得MgrA创造了条件,本着追踪、创新的原则,探索一个切实可行、经济有效的纯化、生产重组的方案,为广泛开展重组mgrA的应用研究及工业化生产莫定基础。