第一部分:外显子捕获技术在乳腺癌易感基因BRCA1剪接突变中的研究背景:乳腺癌(Breast Cancer,BC)是全球女性中常见的一种癌症,在发展中国家的年龄调整发病率约为73%,占所有癌症类型的23%。而与乳腺癌的发生密切相关的基因包括BRCA1,BRCA2,p53,PTEN,STK11/LKB1,CDH1等,其中,BRCA1/BRCA2突变引起的乳腺癌约占总数的5%-10%,这里面又以BRCA1的研究较为广泛,该基因在上世纪90年代就被证实与乳腺癌的发生发展相关,携带BRCA1突变的女性终身将有87%患乳腺癌的风险,确定BRCA1突变点的致病性对乳腺癌临床研究与治疗具有重要的意义。然而目前全球公共数据库中仍然有一半以上的突变位点由于缺乏实验验证,其临床意义至今不明,BRCA1突变相关乳腺癌还存在很大的研究空间。这其中,有很多突变会导致异常剪接的发生,对于这些剪接突变,小基因剪接实验是验证其致病性的有效方法,目前也已经被广泛应用于临床研究中。方法:提取多个有乳腺癌家族史的先证者外周血基因组DNA,对包含乳腺癌在内的多个肿瘤热点基因进行了检测,其中包括TP53、WAN、PTEN、BRCA1/2、EGFR等36个相关基因的检测。针对BRCA1基因,选择了多个不同的疑似致病的突变位点,并最终通过软件预测,筛选出3个不同的疑似会导致异常剪接的BRCA1突变(c.627T>C、c.4347A>G、c.5137G>A),通过外显子捕获载体p SPL3构建携带目标片段的载体,体外转染到COS7细胞中完成剪接,提取细胞RNA通过RT-PCR来验证突变点是否造成异常剪接。结果:剪接实验结果表明BRCA1 c.5137G>A(p.Asp1713Asn)突变引起了17号外显子的跳跃,但是未发现BRCA1c.627T>C(p.Pro209Pro),BRCA1c.4347A>G(p.Thr1449Thr)两个突变点对剪接产生影响。结论:本次研究利用经典的外显子捕获技术(exon trapping technology)确定了新发突变BRCA1c.5137G>A(p.Asp1713Asn)会引起17号外显子的跳跃,导致异常的剪接,根据软件结果显示,该突变点破坏了BRCT结构域,我们猜测该结构域功能发生了改变甚至丧失,导致BRCA1蛋白的抑癌功能发生异常,最终引起或促进了患者乳腺癌的发生。第二部分:全外显子测序技术在Klippel-Trenaunay和ParkesWeber鉴别诊断中的应用背景:随着高通量测序的发展(NGS),对各类普通的临床诊断无法确诊的遗传病也有了新的诊断思路。其中,全外显子测序技术(WES)是基于目标序列捕获技术,利用探针捕获外显子区域的DNA序列,再通过高通量测序发现来检测相关遗传突变的一种基因组分析技术。相比于全基因组测序,外显子组测序周期更短、数据准确性更高、费用更低、覆盖度更深,已经普遍应用于临床上一些单基因遗传病的检测,尤其对于一些无法确诊病因的罕见遗传病,全外显子测序能够很好地帮助临床医生了解病因。Klippel-Trenaunay综合征和Parkes-Weber综合征由于两者症状相似,但治疗和预后都不一样,在临床上很容易被误诊从而耽误后续的治疗。但是,导致这两种疾病的突变基因完全不相同,Klippel-Trenaunay综合征的致病原因目前被发现主要是AGGF1的突变,而Parkes-Weber综合征主要是RASA1基因的突变。利用WES可以很容易对这两种疾病进行鉴别诊断,从而实现精准治疗。方法:提取之前被拟诊为Klippel-Trenaunay综合征患者及其幼子的外周血DNA后,利用全外显子检测技术,检测并确定其致病原因。结果:通过对全外显子检测结果的分析,我们确定了患者发生的RASA1的一个心法突变RASA1 c.810C>G(p.Tyr270*)。进一步通过生物信息学分析,初步判断了该位点的致病性。结论:本次研究中,对之前被拟诊为Klippel-Trenaunay综合征的患者进行WES检测,发现RASA1的一个无义突变(新发突变),最终确诊为Parkes-Weber综合征,为后续针对性治疗提供了确定的依据。另外,我们通过分析突变后的氨基酸序列和功能域改变,初步探索了该突变的致病原因,为后续研究提供了一些基础。