目的:慢性鼻窦炎（chronic rhinosinusitis,CRS）是临床常见的鼻腔鼻窦慢性炎症性疾病,在中国的患病率约为8%,带来沉重的经济和社会负担。作为一种异质性疾病,CRS病理生理学的相关分子机制仍未完全阐明。临床上,常根据息肉的伴发与否将CRS分为慢性鼻窦炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSw NP）和慢性鼻窦炎不伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis without nasal polyps,CRSs NP）2种表型。根据息肉组织内嗜酸粒细胞浸润程度,CRSw NP可进一步分为嗜酸性粒细胞型CRSw NP（eosinophilic CRSw NP,ECRSw NP）以及非嗜酸性粒细胞型CRSw NP（noneosinophilic CRSw NP,non ECRSw NP）2个亚组,前者以Th2型炎症反应为主,后者以Th1/Th17炎症反应为主。ECRSw NP复发率高,预后较差,又被称为“难治性鼻窦炎”。关于CRSw NP中鼻息肉形成的原因有很多理论,包括假性囊肿、水肿和黏膜下腺体结构和功能的改变等。之前一些研究表明Th2型炎症、上皮功能障碍和组织内纤维蛋白沉积之间的共同作用可能部分解释了鼻息肉的发生发展机制,即鼻息肉组织中可观察到黏膜水肿、胶原蛋白沉积和炎性细胞浸润,进而促进了CRS患者凝血酶的激活和纤维蛋白原的裂解,息肉上皮表达低水平的纤溶酶原激活剂,从而降低纤溶,最终导致纤维蛋白积累和息肉生长,除了细胞和结构骨架元素之外,占鼻息肉干重最大百分比的是纤维蛋白和纤维蛋白网中的液体。以上这些现象在ECRSw NP和non ECRSw NP中均有表现,但是鼻息肉的具体形成机制仍未被阐明。炎性细胞及血浆蛋白等血管内物质外渗至组织中,多是由于炎症状态下血管屏障功能受损即血管内皮功能障碍导致的。血管内皮由血管内皮细胞（endothelial cell）参与形成,内皮细胞覆盖在身体中所有类型血管的内表面,在多种生理病理活动中发挥着高度专业化的作用。血管内皮作为循环和周围组织之间的“接口”,大多数细胞间的交流发生在由小动脉、毛细血管和小静脉组成的微血管内。血管内皮并不是一个被动的元素,相反,它具有分泌性、合成性、代谢性、免疫性和表面表达受体等应答功能,在调节多种生理过程中起着关键作用,包括控制血管张力、新生血管生成和调节血管通透性等。血管内皮功能障碍,更确切地描述应该是血管内皮细胞被激活,是多种急、慢炎症性疾病的显著表现之一。在病理条件下的急性炎症期间,如脓毒症、COVID-19或辐射暴露,一连串的炎症事件可改变血管内皮细胞的表型。其在慢性炎症性疾病中,如变应性鼻炎、慢性荨麻疹、类风湿关节炎等也均可出现。现已认识到血管内皮细胞在炎症反应中多个层面,如促炎介质的产生、凝血机制启动、通透性增加、白细胞转运、血管新生和受损器官修复等均起作用,这使内皮细胞成为大多数炎症性疾病状态的关键参与者和潜在的治疗靶点。有研究报道,在CRSw NP中可观察到存在炎症诱导的血管内皮功能障碍,其病理改变包括血管新生、内皮细胞间隙增大、黏蛋白表达增加等。血管内皮细胞激活后间隙增宽,漏出大量血浆蛋白致使组织高度水肿,参与了鼻息肉的形成。也就是说,内皮细胞直接参与导致鼻息肉形成的血管渗漏过程。但是目前CRSw NP中炎症介导的内皮细胞功能障碍导致血管功能障碍形成鼻息肉的全景研究及重要意义尚未引起更多重视。作为一组经典的促炎分子,花生四烯酸（arachidonic acid,AA）及其代谢产物在许多炎症性疾病（如哮喘、关节炎等）、心血管生物学和癌症发生中起着关键作用。其在生物学上的重要性在于它可以被三种不同的酶系统代谢,即脂氧合酶（LOXs）、环氧合酶（COXs）和细胞色素P450（CYP）。其中,花生四烯酸经5-脂氧合酶（5-lipoxygenase,5-LOX）途径催化代谢的产物是白三烯（leukotrienes,LTs）,它是一组具有高度生物活性的脂质促炎介质。在白三烯家族中,LTC4、LTD4和LTE4这三类统称为半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotrienes,Cys LTs）,主要由受到刺激后的嗜酸性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞等产生。前期研究表明,Cys LTs通过与其受体Cys LT1R和Cys LT2R结合来发挥生物作用,二者在体内由血管内皮细胞、支气管平滑肌或其他细胞广泛表达。Cys LTs激活受体后可引起血管通透性增加、炎性细胞聚集、腺体黏液分泌增加及气道平滑肌痉挛等多种病理生理反应,进而参与各种炎症性疾病的发生发展,包括哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、过敏性结膜炎、类风湿性关节炎等。Cys LT1R对经典的受体拮抗剂（如孟鲁司特钠）敏感。相比之下,直到近期还未出现针对Cys LT2R特异性拮抗的治疗方法。目前,针对白三烯及其受体为靶点的抗白三烯治疗,在炎症性鼻病诊治中的作用日益受到关注。对于变应性鼻炎,诸多临床药物实验已经证实抗白三烯治疗能通过降低血管通透性、抑制腺体分泌及减少炎性细胞浸润等作用,改善患者鼻塞、流涕及喷嚏症状。对于CRSw NP,特别是ECRSw NP患者,已在鼻息肉中检测到花生四烯酸代谢失调导致的白三烯途径上调。有研究观察到使用白三烯受体拮抗剂孟鲁司特钠后,鼻息肉中黏蛋白的表达量降低,这使得孟鲁司特钠可能作为鼻息肉治疗的辅助用药,促进CRSw NP患者的恢复。但对于这一结果国际学者暂未持统一意见。故Cys LTs及其受体在CRSw NP发病机制中的作用及其潜在治疗意义有待进一步研究。因此,本研究拟通过对血管内皮功能障碍相关因子的联合检测以及生物信息学挖掘,探讨Cys LTs对血管内皮细胞的作用及其与CRSw NP中鼻息肉发生的关系,从而为CRSw NP患者的抗白三烯治疗提供新的科学证据。材料与方法:1、分别纳入non ECRSw NP患者17例、ECRSw NP患者11例和对照受试者5例,受试者全部来自首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科;2、采用免疫组织化学方法检测鼻息肉组织中血管内皮细胞表面Cys LT1R和Cys LT2R是否表达、炎细胞表面血管内皮来源相关趋化因子对应受体是否表达,并对其进行半定量分析;3、采用RT-q PCR实验方法检测Cys LTs家族成员LTD4、LTE4及其受体拮抗剂Montelukast、Bay Cys LT2R、BAY u9773作用于人脐静脉内皮细胞系（HUVEC）后,血管内皮功能障碍相关目的基因的m RNA水平表达;4、采用ELISA法检测筛选出的血管内皮功能障碍相关因子蛋白表达水平;5、HUVEC细胞系Transwell培养建立体外内皮屏障模型,以Cys LTs及其受体拮抗剂处理后,福特欧姆计检测跨内皮电阻（TEER）、荧光读取器检测FITC-dextran渗透强度来研究内皮细胞的通透性;6、采用磁珠分选技术纯化人外周血嗜酸性粒细胞,并以流式细胞技术检测纯度,用细胞黏附实验检测其与内皮细胞之间的黏附趋化作用;7、采用RNAseq技术深入挖掘LTD4、LTE4及其受体拮抗剂处理HUVEC后引起血管内皮功能障碍的更多机制;8、统计学分析:每项实验均进行3次重复独立实验,采用Graphpad 9.1.2统计软件进行t检验、oneway-ANOVA检验、Spearman相关性分析等,p＜0.05被认为具有显著差异。结果:1、LTD4、LTE4作用于鼻息肉组织内血管内皮细胞:鼻息肉组织标本进行石蜡固定、免疫组化结果示LTD4、LTE4受体Cys LT1R和Cys LT2R在鼻息肉组织血管内皮细胞表面表达;2、LTD4、LTE4可以通过削弱紧密连接及促进白细胞趋化功能两方面促进慢性鼻窦炎伴鼻息肉中血管内皮细胞功能障碍:利用q RT-PCR技术从多个亚功能筛选LTD4、LTE4对内皮细胞影响的可能方向,获得Cys LTs可能在上述两个方面发挥作用,并在后续试验中进一步证实;3、LTD4、LTE4上调内皮细胞ESAM表达,削弱内皮细胞紧密连接:（1）q RT-PCR结果示LTD4、LTE4处理后HUVEC的Esam m RNA水平显著升高（p＜0.05）;（2）Transwell培养HUVEC建立内皮屏障模型（电阻模型）,LTE4、LTD4刺激可引起跨内皮细胞电阻值TEER值显著下降（p＜0.05）;（3）Transwell培养HUVEC建立内皮屏障模型（荧光素渗漏模型）,LTD4、LTE4刺激可引起FITC-dextran渗漏量荧光强度显著升高（p＜0.05）;4、LTD4、LTE4通过与受体Cys LT1R和Cys LT2R结合,影响内皮细胞紧密连接稳定性,且与Cys LT1R关系更为密切:（1）分别拮抗Cys LT1R和Cys LT2R后,以LTD4、LTE4处理HUVEC,q RT-PCR结果示Esam m RNA表达量较单纯刺激组显著降低（拮抗Cys LT1R组p＜0.05）;（2）使用适宜浓度LTE4、LTD4受体Cys LT1R和Cys LT2R拮抗剂预处理后,TEER值较单纯刺激组显著上升,Cys LT1R阻断较Cys LT2R阻断效果更明显;（3）使用适宜浓度LTE4、LTD4受体Cys LT1R和Cys LT2R拮抗剂预处理后,渗漏的FITC-dextran荧光强度较单纯刺激组显著下降;5、LTD4、LTE4上调内皮细胞CCL13、CXCL6及趋化因子受体CCR2、ACKR1表达,促进白细胞趋化功能:（1）q RT-PCR结果示LTD4、LTE4处理后HUVEC,Ccl13、Cxcl6、Ccr2和Ackr1的m RNA水平显著升高（p＜0.05）;（2）ELISA结果示LTD4、LTE4处理后HUVEC的CCL13、CXCL6的蛋白表达量显著升高（P＜0.05）;（3）纯化人外周血嗜酸性粒细胞进行细胞黏附实验,结果示LTD4、LTE4处理后HUVEC的嗜酸性粒细胞黏附率显著升高（p＜0.05）;6、LTD4、LTE4通过与受体Cys LT1R和Cys LT2R结合,影响白细胞趋化功能:（1）分别拮抗Cys LT1R和Cys LT2R后,以LTD4、LTE4处理HUVEC,q RT-PCR结果示Ccl13、Cxcl6及其受体Ccr2、Ackr1的m RNA水平较单纯刺激组显著降低（p＜0.05）;（2）分别拮抗Cys LT1R和Cys LT2R后,以LTD4、LTE4处理HUVEC的ELISA结果示CCL13、CXCL6的蛋白水平较单纯刺激组显著降低（p＜0.05）;（3）分别拮抗Cys LT1R和Cys LT2R后,以LTD4、LTE4处理HUVEC的嗜酸性粒细胞黏附实验结果示嗜酸性粒细胞黏附率较单纯刺激组显著降低（p＜0.05）;7、CRSw NP发病与CCL13、CXCL6、CCR2、ACKR1有关,ECRSw NP与non ECRSw NP发病机制可能不同:（1）鼻息肉组织标本RT-PCR结果示,ECRSw NP组与non ECRSw NP组相比,Ccl13m RNA水平显著升高（p＜0.05）,Ackr1、Cxcl6m RNA水平显著降低,Ccr2 m RNA水平两组间无统计学差异;（2）检索GEO数据库公开发表数据（GSE72713）,CCL13、CXCL6在鼻息肉中表达,且ECRSw NP与non ECRSw NP表达量存在差异。具体结果示Ccl13在ECRSw NP中比非息肉对照组基因表达量升高（FPKM log2（foldchange）=5.98484）,在ECRSw NP中比nonECRSw NP基因表达量升高（FPKM log2（foldchange）=9.02834）。Cxcl6在nonECRSw NP中比非息肉对照组基因表达量升高（FPKM log2（foldchange）=2.02165）,在ECRSw NP中比non-ECRSw NP中基因表达量降低（FPKM log2（foldchange）=-2.8006）。Ccr2在ECRSw NP中比非息肉对照组基因表达量升高（FPKM log2（foldchange）=1.1532）;（3）鼻息肉组织免疫组化结果示CCR2和ACKR1在嗜酸性粒细胞等多种炎细胞表面有表达,且ECRSw NP与non ECRSw NP表达量存在显著差异:半定量分析结果示ECRSw NP患者鼻息肉组织中CCR2阳性染色嗜酸性粒细胞显著高于non ECRSw NP患者（p＜0.05）,non ECRSw NP患者息肉组织中ACKR1阳性染色嗜酸性粒细胞显著高于ECRSw NP患者;（4）检索GEO数据库公开发表数据（GSE3982）,验证CCR2和ACKR1在嗜酸性粒细胞等多种人外周血炎细胞中表达;（5）临床病例Spearman相关性分析表明,鼻息肉中Ccl13水平与外周血中嗜酸性粒细胞百分比（r=0.6047,p=0.0169）、中性粒细胞百分比（r=0.6052,p=0.0485）及单核细胞百分比（r=0.5807,p=0.0183）呈显著正相关,而与外周血淋巴细胞百分比呈显著负相关（r=-0.5240,p=0.0450）,与Lund-Kennedy内镜黏膜形态评分呈显著正相关（r=0.5918,p=0.0201）;（6）临床病例Spearman相关性分析表明,鼻息肉中Cxcl6水平与外周血中嗜酸性粒细胞百分比（r=0.5813,p=0.0372）、单核细胞百分比（r=0.5749,p=0.0250）及淋巴细胞百分比（r=0.6319,p=0.0205）呈显著正相关,而与外周血中性粒细胞百分比呈显著负相关（r=-0.5785,p=0.0488）,与LundKennedy内镜黏膜形态评分（r=0.5570,p=0.0385）呈显著正相关;8、RNA测序（RNAseq）结果示LTD4、LTE4及其受体Cys LT1R、Cys LT2R对内皮细胞功能障碍的促进作用,可能与Apelin信号通路有关:通过主要成分分析（PCA）对LTD4、LTE4及其受体拮抗剂处理的HUVEC转录组进行分析。发现刺激剂组与拮抗剂组之间的转录组特征显著差异,提示LTD4及LTE4及其拮抗剂可导致内皮细胞不同的生物学改变。筛选出在（LTD4/LTE4 VS对照组）中明显上调并在（LTD4/LTE4+拮抗剂VS LTD4/LTE4）中明显下调的基因,并对其功能进行注释,发现这些基因功能主要与脂质代谢、细胞连接、细胞间信号传导等相关,这些结果在基因富集分析（GSEA）中也得到验证。LTD4和LTE4组共同存在Apelin信号通路的基因富集。说明LTD4与LTE4通过Apelin信号通路作用于HUVEC,上调白细胞趋化因子及黏附分子从而影响内皮细胞屏障功能。结论:在CRSw NP中,LTD4、LTE4作用于血管内皮细胞表面的受体Cys LT1R和Cys LT2R,通过上调ESAM削弱血管内皮紧密连接稳定性,同时上调CCL13、CXCL6促进白细胞趋化作用,促进慢性鼻窦炎伴鼻息肉中血管内皮细胞功能障碍,参与鼻息肉的发生发展,这一过程可能与Apelin通路有关。