研究背景氧化应激涉及人类多种疾病,尤其是在肿瘤、阿尔采默症、帕金森、糖尿病等疾病的发生发展和衰老进程起着重要作用。亦有研究发现,几乎所有肿瘤细胞都存在细胞内氧化-抗氧化系统失衡这一共性,氧化应激水平增高,处于低抗氧化状态。氧化应激会导致DNA损伤。DNA损伤会引发细胞多种反应,如DNA修复、细胞周期阻滞或延迟、细胞凋亡坏死等。DNA损伤的形式有多种,其中DNA双链断裂（Double Strand Breaks,DSBs）是DNA损伤中最具有致命性作用的损伤之一。DSBs可能促进肿瘤发展的基因组改变,因此,DSBs的修复对于细胞存活和基因组完整性的维持至关重要。DSBs修复途径主要包括以DNA依赖蛋白（DNA-dependent protein kinase,DNA-PK）介导的非同源末端连接和共济失调毛细血管扩张突变蛋白（Ataxia-telangiectasia-mutated,ATM）介导的同源重组。MRN复合物（MRE11-RAD50-NBN）作为DNA双链断裂的感应器,通过ATM依赖的细胞周期检测位点的调控连接DNA损伤反应（DNA Damage Response,DDR）修复,并协同其他蛋白质促进DSBs修复。在肿瘤中热休克蛋白90（Heat shock protein 90,Hsp90）呈现高表达,且参与DNA损伤修复过程的多种关键蛋白均为其底物蛋白。Hsp90在维持体内蛋白质稳态的过程中,发挥着不可或缺的作用。已知Bcl-2相关转录因子（BCL2-associated transcription factor 1,Bclaf1/Btf）是 Hsp90 底物蛋白,同时也参与了 DDR。因此,Hsp90是否协同Bclaf1共同通过调控MRN复合物活性,进而影响DSBs损伤修复,其机制有待探讨。目的1.建立H2O2诱导的氧化应激模型,并评价其DNA双链断裂变化情况;2.确定氧化应激处理和Hsp90α敲除对细胞凋亡的影响;3.研究氧化应激条件下细胞内DNA双链损伤修复相关分子的表达情况以及Hsp90α变化情况。4.探讨Hsp90α是否协同Bclaf1通过调控MRN复合物活性影响DNA双链损伤修复,及其具体机制。方法1.蛋白免疫印迹分析细胞内DNA损伤修复通路关键分子的蛋白表达情况。2.流式细胞术分析细胞凋亡率。3.中性彗星实验分析DNA双链断裂损伤情况。4.聚合酶链反应分析细胞内DNA损伤修复通路关键分子的mRNA表达情况。5.染色质免疫共沉淀分析Hsp90α和Bclaf1在NBN基因的结合情况。6.统计分析:应用SPSS 21.0进行。实验数据均以x±s表示。多组间的比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA）,两独立样本组间的比较采用t检验,实验组与对照组的比较采用Dunnett法。检验水平为P＜0.05。结果1.Hsp90α敲除影响HepG2细胞和MDA-MB-231细胞中DNA损伤修复通路关键蛋白表达,氧化应激下尤甚。2.在不同浓度H2O2处理下,随着浓度的增加,DNA双链断裂加剧,细胞存活率降低,凋亡率增高,Hsp90α敲除细胞较野生型细胞更为敏感;γH2AX的蛋白水平也随着浓度的增加而明显增多,Hsp90α敲除细胞中γH2AX的蛋白水平较野生型细胞低。3.RNAseq结果显示HepG2细胞中Hsp90α的敲除导致DNA变异数量相对增加;Hsp90α敲除影响HepG2细胞中DNA损伤修复通路关键基因的转录,导致MRN复合物的mRNA水平明显下调。4.Hsp90α敲除抑制氧化应激后NBN在γH2AX foci的聚集。5.Bclaf1基因敲低抑制了 Huh7细胞的DNA损伤修复反应,相关DNA损伤修复通路关键基因表达水平均下调。6.Bclaf1和Hsp90α均能特异性结合在NBN启动子区域,参与调控其转录。结论Hsp90α通过协同调控DNA损伤修复通路关键蛋白的稳定来实现对γH2AX水平的影响。Hsp90α有促进DNA损伤修复,减少细胞凋亡的作用。在氧化应激中Hsp90α起保护作用。Hsp90α调控DNA损伤修复通路关键基因的转录,Hsp90α敲除导致MRN复合物的mRNA水平明显下调。Hsp90α敲除抑制氧化应激后NBN水平并抑制其招募到γH2AX foci。Bclaf1基因敲低抑制了细胞的DNA损伤修复反应。Bclaf1和Hsp90α均参与调控DNA损伤修复通路关键蛋白NBN的转录,并存在可能的交叉调控通路。