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目的：
研究Mithramycin A(光辉霉素)对人肝癌细胞Huh-7的促凋亡作用。通过构建质粒表达载体，运用RNAi技术，为探索阻断核转录因子Sp1信号通路的新途径及其下游信号通路研究奠定基础。
方法：
采用CCK-8活细胞计数试剂盒观察Mithramycin A对Huh-7细胞的生长抑制作用。通过倒置显微镜观察Mithramycin A作用后细胞形态变化，Hoechst33342/PI双荧光染色分析细胞凋亡，流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。运用Realtime-PCR法和Western-blot法检测Mithramycin A不向浓度及不同时间作用后Huh-7细胞中Sp1、VEGF、c-Met、EGFR表达情况。将Sp1 shRNA(短发夹状RNA，short hairpin RNA)序列克隆到质粒pGCsi3.0载体，采用HilyMax脂质体介导的转染方法将构建的Sp1 shRNA表达质粒转入Huh-7细胞。采用实时定量PCR技术和Western-blot技术分别检测Huh-7细胞中Sp1、VEGF、c-Met和EGFRmRNA和蛋白表达水平的变化。
结果：
Mithramycin A可抑制Huh-7细胞的生长，其机制与诱导细胞凋亡有关。这种抑制作用呈浓度及时间依赖性，半数抑制浓度(IC50)为60.12nmol/L。浓度为5×10-2μmol/L的Mithramycin A作用细胞72h后可明显诱导细胞凋亡，流式细胞仪检测肿瘤细胞出现典型亚二倍体凋亡小峰。Mithramycin A对Sp1、VEGF、c-Met、EGFR在蛋白水平的表达有抑制作用。Sp1 shRNA表达质粒能有效地抑制Huh-7细胞Sp1、VEGF、c-Met和EGFR mRNA和蛋白质表达水平。
结论：
Mithramycin A对Huh-7细胞有明显的生长抑制和诱导凋亡作用。Mithramycin A能抑制人肝癌Huh-7细胞Sp1及其下游基因表达。siRNA Sp1可下调Sp1表达，Sp1表达水平和VEGF、c-Met和EGFR表达水平呈正相关。