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目的:探讨初治急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者诱导治疗后获得首次骨髓形态学完全缓解(complete remission,CR1)时,采用多参数流式细胞术(multiparameter flow cytometry,MFC)及Wilms瘤基因1(Wilms tumor1 gene,WT1)表达检测微小残留病(minimal residual disease,MRD),通过检测MFC-LAIP联合WT1的水平变化,对AML患者进行无复发生存(relapse-free survival,RFS)、总体生存率(overall survival,OS)等预后分析,以期指导临床后续治疗。方法:分析2010年10月至2016年10月山西医科大学第二医院血液科病房收治的持续接受治疗的179例初治AML(M3除外)患者的临床资料,所有患者均获得CR/CRi/CRp,分析CR1时骨髓检测MFC-LAIP、WT1水平在预测RFS、OS及指导个体化治疗等方面的作用。1、骨髓(bone marrow,BM)标本来自AML患者。诊断及分类标准依据2016年世界卫生组织(World Health Organization,WHO)。对所有患者初治及CR1后的BM样本进行MFC-LAIP(leukemia associated immunophenotype)及WT1表达水平检测。本实验是在骨髓细胞水平进行的实验。所用标本均来源于山西医科大学第二医院血液科因诊疗需要抽取的BM(获得患者知情同意)。2、每例患者在初治及CR1后取BM 2-4ml,用FC500(Beckman公司)MFC检测抗原表达及原始细胞计数,数据分析用CXP Analysis软件。每个组合补偿设定用未标记的同型对照。检测前行Flow-check测试激光和补偿的稳定性。MFC进行免疫表型分析。单克隆抗体主要包括:CD45-PC7,CD38-FITC,CLL-1-PE,CD34-PC5,CD7-FITC,c MPO-PE,CD19-PC5,CD34-FITC,CD11b-PE,CD15-PC5,CD56-PE,CD117-PC5。同时采用实时定量荧光PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测WT1。3、MFC分析以前向角/侧向角(forward scatter/side scatter,FSC/SSC)射门去除死细胞和碎片,每管至少获取10万个细胞,以CD45和SSC(CD45/SSC)射门。患者骨髓细胞染色阳性为抗原表达超过20%的CD45/SSC细胞群,评估的最低有效细胞数是40。抗原表达强度以阳性细胞群的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)来确定,评估的最低有效细胞数是500。若在筛选时白血病细胞出现的区域内仍有细胞存在且表型异常,即判断为残留白血病细胞,以这些残存的细胞占骨髓有核细胞总数的比例作为MRD的数值。MRD定量值≤10-4与为阴性,≥10-4之为阳性。4、WT1表达以欧洲白血病网络公认的比值法计算,用RT-q PCR测定WT1和ABL基因,以ABL基因为内参。WT1/ABL×10000>60为高表达,<60为低表达。结果:1、179例初治AML患者中,男88例,女91例,中位年龄47岁(15-73)岁,依据WHO(2016)分型:AML伴t(8;21)29例,AML伴t(16;16)/inv(16)9例,AML伴inv(3)/t(3;3)1例,M0 5例,M1 12例,M2 15例,M4 53例,M4EO 4例,M5 25例,M6 4例,AML伴骨髓增生异常相关改变11例,治疗相关AML11例。依据NCCN(2017)指南:低危37例,中危117例,高危25例。中位随访时间为23月(6-76)月,目前共100例患者复发,复发多发生在CR1后2年内,76例早期复发(≤12个月)。死亡62例,其中55例死于复发。中位RFS 21月(4-75月),中位OS 28月(6-76月)。2、在73例AML患者中分析C型凝集素样受体-1(C-type lectin-like receptor-1,CLL-1)在MRD检测中的作用。研究发现,CLL-1表达在正常对照骨髓细胞的粒细胞、单核细胞,不表达在淋巴细胞、有核红细胞和CD34+CD38-细胞;在91.8%AML患者白血病细胞和粒细胞、单核细胞表达,在CD34+CD38-细胞表达阳性率为71.2%,且在疾病CR前后表达稳定,而在CD34+与CD34-AML患者中表达无差异(P=0.43)。3、首次骨髓形态学CR后107例患者MFC-LAIP转阴,72例患者MFC-LAIP仍为阳性。MFC-LAIP阳性患者与阴性患者一般特征相比,发病时外周血白细胞计数、BM、MFC及外周血原始细胞比例更高,血小板计数更低,多为合并中枢神经系统白血病(central nervous system leukemia,CNSL)、高白细胞计数、治疗相关、中高危患者,初次诱导CR率低,但差异均无统计学意义(P值均>0.05),MFC-LAIP阳性患者2个疗程未CR比例明显多于阴性患者(P=0.029),RFS、OS明显缩短(24月vs 11月,35.5月vs 21月,P<0.001)。4、73例AML患者中,57例(78.1%)患者初诊WT1高表达,16例(21.9%)患者初诊WT1表达不高,其中9例在CR1后WT1高表达,低、中、高危分别2例、4例、3例,老年患者4例,7例发生早期复发。WT1表达水平与外周血白细胞计数、血红蛋白浓度、血小板计数、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)、预后分层无相关关系。5、多因素分析发现MFC-LAIP、WT1水平为影响AML患者RFS、OS的独立因素。分析不同危险度分层患者,发现MFC-LAIP水平为影响中危、高危患者RFS的独立因素;中危患者OS的独立影响因素,而不是低危患者RFS、OS的独立影响因素。6、评估MFC-LAIP、WT1水平在AML患者预测复发、评估预后中的效能。发现MFC-LAIP≥1.35%组与<1.35%组相比5年RFS率明显降低(P<0.001),该界值的灵敏度为0.575,特异度为0.818;MFC-LAIP≥1.70%组与<1.70%组相比5年OS显著降低(P<0.001),灵敏度为0.714,特异度为0.769。CR1后WT1水平≥40患者与<40患者相比18月RFS明显降低(P=0.049),CR1后WT1水平≥50与<50患者相比,20月的OS明显降低(P=0.02);MFC联合WT1表达检测CR1后MRD可提高AML患者预测RFS、OS的灵敏度,而不影响特异度。进一步亚组分析不同疗程达CR患者,发现仍可提高灵敏度,不影响特异度,但权重不同。结论:1、CR1后MFC-LAIP是影响AML患者RFS、OS的独立因素,可能对CR后分层治疗扮演重要甚至主导角色,但在不同危险度分层患者中权重不同。CLL-1可以作为AML诊断、MRD检测及靶向治疗的标记。2、CR1时WT1水平分别≥40及≥50预示更短的RFS、OS;初治时表达正常,CR1后WT1高表达者,多为中高危、老年患者,复发率高。3、MFC联合WT1检测可作为AML MRD检测的良好手段,可提高MRD检测水平的灵敏度,而不影响特异度。