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实验目的胰岛素基因转录由胰岛素启动子引发,在这个过程中有许多转录调节因子参与,通过提高体内转录因子的产量,从而提高胰岛素基因的转录是一种可能有效的途径。肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A ( Mus musculus v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family,protein A,MafA)是最近分离出来的转录因子,具有胰腺β细胞特异性[1],对于胰腺生长和β细胞(产生胰岛素的细胞)的分化及维持正常的β细胞功能至关重要[2]。本实验拟构建可以表达小鼠MafA基因的真核表达质粒,转染入人肝癌细胞HePG-2,观察MafA基因在细胞中的表达,为进一步研究MafA功能及其作用机制奠定实验基础。实验方法1.提取小鼠胰腺总RNA,经RT-PCR获得MafA基因片段,并在两端分别引入HindⅢ和SalⅠ酶切位点,重组至有增强绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N2,pEGFP-C1中。2.用脂质体转染至人肝癌细胞HePG-2细胞中,再通过三种不同葡萄糖浓度刺激已转染质粒的HepG2细胞,用荧光显微镜观察荧光表达,通过RT-PCR检测MafA基因和insulinⅡ基因的表达,通过WesternBlot检测融合蛋白EGFP- MafA的表达。实验结果1.通过RT-PCR鉴定重组质粒时,在1080bp获取了明亮的条带。基因测序测得所获得得基因序列与GENEBANK报道MafA基因序列一致。2.转入重组质粒的细胞有绿色荧光蛋白表达。Western Blot检测重组质粒表达时在70KD左右可见明显的条带。3.通过RT-PCR检测insulinⅡ表达时,没有得到目的条带。实验结论1.利用带有绿色荧光蛋白序列为报告基因的pEGFP-N2和pEGFP-C1,成功构建了可表达融合基因EGFP-MafA的真核表达质粒。pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA。2.pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA重组质粒在肝癌细胞内可以成功表达融合蛋白MafA-EGFP,但是未诱导出胰岛素的表达,实验结果提示pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA表达质粒的转染可能不足以诱导肝癌细胞分泌胰岛素。