糖尿病是一种严重危害人类健康的以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病。胰岛移植是是最有希望治疗糖尿病的方法之一,但胰岛移植后,胰岛的功能会在半年到几年内逐渐消失,且面临着供体缺乏和免疫排斥的问题。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓中除造血干细胞之外的另一类具有高度增殖和自我更新能力以及多向分化潜能的成体干细胞,易于体外分离、培养及扩增,在特定的条件下可以分化为胰岛细胞,且避免利用胚胎干细胞涉及的理论问题和诱导性多潜能干细胞所产生的技术安全性问题,是一种理想的组织工程种子细胞。然而如何使BMSCs稳定、高效地定向分化为胰岛细胞,并搞清楚相关诱导方案中BMSCs分化为胰岛细胞的分子调控机制是一个巨大的挑战。本研究以1月龄日本大耳白兔为实验对象,体外分离、培养、扩增兔BMSCs,观察兔BMSCs形态变化,免疫细胞化学法鉴定兔BMSCs;建立稳定的兔BMSCs定向分化为胰岛细胞的诱导方案,并分析兔BMSCs体外定向分化为胰岛细胞的分子调控机制;探索DNA甲基化抑制剂5-aza-dc对兔BMSCs的最适干预浓度和其对胰岛细胞分化的影响。本实验为进一步探索更成熟的诱导方案和BMSCs替代治疗糖尿病提供理论依据和技术支持。1.本试验采用全骨髓贴壁法分离获得的兔BMSCs生长增殖能力强,生物学性状稳定。对分离到的骨髓细胞通过24h首次半量换液,以后每2d换液一次,1:2传代培养至第3代。细胞免疫化学法鉴定P3代细胞,结果显示:其阳性表达CD44、CD90,阴性表达CD34,这符合BMSCs表面分子标记特征,且传代至第3代可获得大量生长良好、增殖能力强的兔BMSCs。这表明所获第3代细胞为兔BMSCs,所用分离纯化培养方法是一种比较理想的体外分离纯化培养兔BMSCs的方法,并且可选用P3代兔BMSCs作为后续研究的实验对象,为接下来的诱导试验奠定了基础。2.本试验采用DMSO联合高糖对第3代兔BMSCs进行体外诱导,于倒置显微镜下观察诱导组和对照组细胞形态变化,双硫腙染色鉴定细胞,细胞免疫荧光染色鉴定Insulin蛋白的表达,RT-qPCR法检测诱导过程中胰岛细胞相关基因的表达情况。得出以下结论:(1)Foxa2、Nestin、Pax6基因不能被选为兔BMSCs向胰岛细胞诱导分化成功的标志基因。(2)DMSO联合高糖能够将兔BMSCs诱导分化为具有胰岛素分泌功能的胰岛样细胞,兔BMSCs具有向内胚层细胞分化的潜能。(3)DMSO能够激活Pdx-1基因的表达,从而起到促进兔BMSCs分化为可分泌胰岛素的胰岛前体细胞的作用。(4)高糖能够促进胰岛前体细胞的成熟和兔BMSCs向胰岛细胞的分化,该促进作用可能主要是通过促进Pdx-1和Foxa2基因的表达来完成的。3.本试验采用MTT法检测不同浓度5-aza-dc干预第3代兔BMSCs24h后对其体外增殖能力的影响,并确定最适干预浓度;用筛选出的最适干预浓度的5-aza-dc干预兔BMSCs24h后,采用DMSO联合高糖法进行诱导,于倒置显微镜下观察诱导组和对照组细胞形态变化,双硫腙染色鉴定细胞,细胞免疫荧光染色鉴定Insulin蛋白的表达,RT-qPCR法检测诱导过程中5-aza-dc对胰岛细胞相关基因表达的影响。得出以下结论:(1)5-aza-dc对兔BMSCs的最适干预浓度为1.5μmol/L。(2)5-aza-dc能够促进胰岛前体细胞的成熟和兔BMSCs向胰岛细胞的分化,该促进作用可能是通过抑制DNA甲基转移酶的活性使得Pax6、Pdx-1和Insulin基因去甲基化,从而导致Pax6、Pdx-1和Insulin基因激活、转录、表达增强来实现的。(3)低甲基化程度能够促进Pax6、Pdx-1和Insulin基因的表达。