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在卵泡生长发育过程中,大多数卵泡都发生了闭锁退化,只有少数卵泡能够发育成熟和排卵,如果排出的卵母细胞未及时受精则发生老化,将严重影响后续的发育潜能。线粒体在动物卵泡发育、卵子成熟及其后续胚胎发育的过程中起着重要作用。研究发现,线粒体转录相关因子PGC-1α(过氧化物酶体增生激活受体丫协同刺激因子)和NRF-1(核呼吸因子-1)能协同促进线粒体增殖,对调控线粒体的功能和抵抗氧化损伤有重要的作用,然而关于其调控卵泡闭锁、卵母细胞老化以及体外胚胎发育的研究还比较少。随着辅助生殖技术的发展,对卵母细胞质量的要求越来越高,选择优质胚胎进行移植也显得尤为重要。因此,了解卵泡发育与闭锁的规律、探索卵母细胞老化的分子机制和找出能预测胚胎发育潜能的标记物,对丰富内分泌·生殖生理学和完善辅助生殖技术具有重要意义。本试验主要分为以下四个部分:试验一、PGC-1α和NRF-1在山羊卵泡发育和闭锁过程中表达变化的研究剥离性成熟山羊卵巢中的卵泡,然后按照不同直径(≤2 mm、2～5 mm和≥ 5mm)和状态(健康和闭锁)分组,通过qRT-PCR和Western blot等方法,初步探索PGC-1α和NRF-1在山羊卵泡发育和闭锁过程中的表达变化。结果表明:PGC-1α、NRF-1、BCL-2和BAX四个蛋白主要在各发育阶段卵泡的颗粒细胞内表达。随着卵泡的发育(卵泡体积的增大),PGC-1α和NRF-1的表达量(mRNA和蛋白)显著升高(P<0.05)。与健康卵泡相比,闭锁卵泡内雌激素的含量和雌激素/孕酮的比值显著降低(P<0.05),并且PGC-1α和NRF-1的表达量也有降低的趋势,而BAX的表达量与BAX/BCL-2的比值显著升高(P<0.05)。综上所述,在山羊卵泡发育过程中,PGC-1α和NRF-1基因表达模式的改变,可能会导致卵泡闭锁。试验二、PGC-1α和NRF-1调控体外培养山羊颗粒细胞凋亡的研究分离健康卵泡的颗粒细胞进行体外培养,通过干扰或过表达PGC-1α与NRF-1基因,研究PGC-7α与NRF-1对体外培养颗粒细胞凋亡的调控。结果表明:PGC-1α与NRF-1蛋白主要在颗粒细胞的胞质内表达,干扰PGC-1α或NRF-1能显著减少颗粒细胞内mtDNA的拷贝数(P<0.05);减少SOD2、GPx和C471的表达量(P<0.05);增加Caspase 3、Caspase 9和BAX基因的表达量以及BAX/BCL-2的比值(P<0.05);增强细胞内Caspase 3和Caspase 9的活性(P<0.05),改变细胞内BAX和BCL-2的蛋白表达量(P<0.05),并显著增加颗粒细胞的凋亡率(P<0.05)。过表达PGC-1α与NRF-1能在一定程度上抑制颗粒细胞凋亡的发生。此外,流式细胞周期检测发现,干扰或过表达PGC-1α与NRF-1对颗粒细胞周期无显著性影响。综上所述,在体外培养的颗粒细胞中,PGC-1α与NRF-1的表达异常,可能会导致颗粒细胞的凋亡。试验三、PGC-1α和NRF-1在山羊卵母细胞老化过程中作用的研究首先通过孤雌激活胚胎的发育率和TUNEL凋亡检测判断体外培养卵母细胞老化的时间点(24、30、36、48和60 h),然后在卵母细胞(成熟和未成熟)和卵丘细胞中通过 qRT-PCR 检测目的基因(PGC-1α、NRF-1、HAT1、SNRPN、HAS 3、SMAD2、AAX、BCL-2、HAS 2、STAR和SOD 1)的表达变化,并试图通过卵丘细胞基因的表达变化预测卵母细胞的老化进程。结果表明:随着卵母细胞体外培养时间的延长(24～60 h),孤雌激活的囊胚率显著降低(P<0.05),凋亡的卵丘细胞显著增多(P<0.05)。在成熟的卵母细胞中,PGC-1α、NRF-1和SMAD2基因的表达量随着培养时间的延长(24～36h)而显著降低(P<0.05);HAT1和HAS 3基因的表达量随着培养时间的延长(24-60 h)而缓慢升高。目的基因在未成熟卵母细胞中的表达模式与在成熟卵母细胞中的表达模式相似。另外,在卵丘细胞中,随着培养时间的延长(24～36 h),PGC-1α、SCL-2、H2和>SOD1基因的表达量显著降低(P<0.05),而BAX基因的表达量显著升高(P<0.05)。综上所述,在山羊卵母细胞体外培养过程中,卵母细胞的老化开始于体外培养的第30 h,伴随着卵母细胞的老化,卵母细胞和卵丘细胞的基因表达模式均发生了明显的改变。线粒体相关基因可能是预测卵母细胞质量的潜在分子标记物。试验四、PGC-1α和NRF-1评价山羊转基因克隆胚胎体外发育潜能的初步研究基于以上研究,本试验拟进一步从代谢物质变化角度分析线粒体相关基因与胚胎发育潜能是否存在相关性。因此,本试验以山羊转基因克隆胚胎为研究对象,根据不同的形态标准(高质量:A vs低质量:B)对胚胎进行分组培养,体外发育至囊胚时,收集各组的囊胚和对应的胚胎代谢液进行分析。结果发现,A组的囊胚率显著高于B组(P<0.05)。气相色谱-质谱联用技术分析发现,不同组间代谢液中有多种显著性的代谢差异物,这些物质的变化多与氨基酸和能量代谢相关,而线粒体又是能量代谢中心。因此,本试验进一步分析了线粒体相关基因在克隆胚胎中的表达。qRT-PCR结果发现,在低质量组(B组)的囊胚中,线粒体相关基因PGC-7α和NRF-1的表达量显著降低(P<0.05),BAX/BCL-2的比值显著升高(P<0.05)。这一结果提示:在低质量的胚胎中,PGC-1α和NRF-1的表达异常,可能会导致线粒体的损伤进而影响山羊转基因克隆胚胎的质量。综上所述,结合胚胎的形态评估,找出与山羊转基因克隆胚胎质量密切相关的分子和代谢标记物,为寻找预测胚胎发育潜能的研究提供了参考,将有助于筛选出优质的移植胚胎和提高转基因克隆的效率。