论文部分内容阅读
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类多潜能成体干细胞，广泛存在于动物胎儿和成体多种组织器官中，例如:脂肪、软骨、骨髓、羊水、脐带和胎盘等[1-5]。MSCs可以向肿瘤归巢，参与肿瘤基质形成，通过分泌一些细胞因子影响肿瘤细胞的增殖、迁移和肿瘤血管的形成，并且能够改变肿瘤内源性miRNAs的表达水平，进而影响肿瘤细胞的生物学行为[6]。 课题组前期研究发现，一定浓度的UC-MSCs条件培养基能够抑制肝癌HepG2的增殖。为深入了解其分子机制，我们首先对UC-MSCs条件培养基处理HepG2不同时间(1h、6h、12h、24h)后的4个处理组和对照组HepG2(0h)样本进行Small RNAs高通量测序，构建了miRNAs差异表达谱。结果显示:从对照组到处理组的5组cDNA文库中，分别获得1091、1079、1164、1086和1193万余条干净序列;与基因组比对发现，每组样本均达到67％以上的基因组覆盖率;进一步与miRBase数据库比对发现，5组样本分别检测出942，995，1031，976和958种miRNAs成熟体。另外，处理组与对照组比对差异表达miRNAs数目表明，随着条件培养基处理时间的延伸，差异表达的miRNAs数目逐步增多，miRNAs的表达始终处于持续变化的状态。此外，为了验证测序结果的可靠性，用qRT-PCR方法对10个差异表达的miRNAs进行了验证，结果显示，miRNAs的表达趋势与测序结果基本一致。 其次，采用TargetScan软件预测了差异表达miRNAs的可能靶基因，并对这些靶基因进行GO功能和KEGG信号通路注释。结果显示:这些差异表达miRNAs的候选靶基因主要集中在细胞转录调控、细胞增殖、凋亡和信号转导等生物学功能中;这些候选靶基因显著富集于多条信号通路中，例如:MAPK信号通路、Wnt信号通路、钙离子信号通路、单纯疱疹感染和氨基糖代谢等通路;这提示UC-MSCs条件培养基确实会影响HepG2细胞的生理生化相关信号通路。 再次，为更好地阐明UC-MSCs条件培养基抑制HepG2增殖的分子机理，我们将HepG2细胞的Small RNAs数据与前期实验室分析该样本转录组数据进行关联分析。结果发现:上调miRNAs与下调mRNAs之间的互作调控模式有12条;下调miRNAs与上调mRNAs之间的互作调控模式有5条。例如:输出数据中，差异倍数较大的miR-375负调控基因ARHGAP21和JUND的表达，表达丰度较高的let-7f-3p和miR-34a-3p协同抑制因子IL6的表达。 最后，筛选出增殖条目下的差异表达miR-3065-5p进行功能验证，体外实验证实，过表达miR-3065-5p可以显著抑制HepG2细胞的增殖和侵袭，说明miR-3065-5p是一个潜在的肿瘤抑制miRNA。此外，miR-3065-5p过表达可降低HepG2细胞中的SATB1的表达，可推测SATB1极有可能是miR-3065-5p的靶基因。