论文部分内容阅读
禽流感(Avian influenza,AI)是由流感病毒属的禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的禽类感染和疾病的总称,尤其是高致病性禽流感(High pathogenic avian influenza, HPAI)可导致高达100%的发病率和死亡率,并可感染人和致人死亡,不仅给世界各国的畜牧业和国际贸易带来巨大的经济损失,而且严重威胁着人类健康。而AIV血清型众多,抗原变异性强,宿主范围广,各亚型间几乎没有交叉保护性,是进行诊断和防控的难点。基因芯片技术作为一种比较系统、完善的检测技术成为近年来研究的热点,为建立快速、敏感、特异的AIV所有亚型分型检测技术,及早发现新流行亚型,有效监控禽流感,本论文对AIV分型基因芯片技术进行初步研究。论文由两个部分构成,第一部分是设计25对引物,对AIV多重RT-PCR进行研究;第二部分是进行多重不对称RT-PCR扩增,设计探针制备病毒分型基因芯片,对AIV 25个亚型分型基因芯片检测方法进行初步研究。主要实验和结果如下:(1)根据Genebank中已发表的AIV不同亚型的基因保守序列,设计和合成AIV 25对特异性引物;对已获得标准毒株的亚型,提取病毒RNA进行多重RT-PCR扩增;对未能获得标准毒株的亚型,设计和合成用于搭桥PCR技术的203条寡核苷酸片断,采用搭桥PCR技术获得各亚型目的基因,将其随机分成3组进行多重RT-PCR扩增;进一步特异性和敏感性试验,对AIV多重RT-PCR扩增进行研究;用标准毒株的病毒RNA(不包括H16和N7亚型)对多重RT-PCR进行验证试验,应用此多重RT-PCR和病毒分离经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行平行检测。结果表明:本试验通过搭桥PCR技术成功获得了未能获得AIV标准毒株17个亚型的目的基因,与禽类常见6种病毒(IBV﹑ARV﹑IBDV、NDV、FPV、MDV)扩增均为阴性,其H5N1的敏感度可达247 pfu,AIV参考毒株H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H12、H14、H15、N1、N2、N3、N4、N6、N8、N9亚型均扩增出较亮的目的条带,H11、H13和N5亚型目的条带稍弱,平行检测结果完全吻合。(2)在多重RT-PCR基础上对通用引物介导的多重不对称RT-PCR进行研究;基于扩增的靶序列和Genebank中已发表AIV不同亚型的基因序列,设计AIV分型探针和质控探针,对其修饰并合成,用芯片点样仪将探针固定到玻片上,制备AIV基因检测芯片;并测定其特异性和敏感性,对AIV分型基因芯片检测方法进行初步研究。结果显示:与IBV﹑ARV﹑IBDV、NDV、FPV、MDV均无交叉反应,AIV各亚型探针位点均出现各自的检测信号,扩增目的片段敏感性可达2.5 ng;该方法具有较好的特异性和敏感性。