论文部分内容阅读
目的：利用肺炎衣原体(Chlamdia pneumoniae, C.pn)体外感染大鼠血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)模型,分析C.pn感染对VSMC(?)细胞迁移相关基因表达的影响：观察C.pn感染对VSMC粘附和迁移能力的影响；探讨IQGAP1在C.pn感染诱导VSMC粘附和迁移中的作用。方法：1.C.pn增殖培养后体外感染大鼠VSMC;2.应用基因芯片技术分析C.pn感染大鼠VSMC12h后,VSMC内细胞迁移相关基因表达的改变；3.运用MTT去观察C.pn感染对VSMC粘附能力的影响；4.应用Transwell实验观察C.pn感染对VSMC迁移能力的影响；5.利用RT-PCR技术检测C.pn感染的VSMC内IQGAP1mRNA的表达水平；6.采用Western blot技术检测C.pn感染的VSMC为IQGAP1蛋白的表达水平；7.应用RNA干扰技术使IQGAP1表达水平下调,RT-PCR技术检测IQGAP1mRNA的表达,以确定干扰效果；8.运用MTT法观察RNA干扰下调IQGAP1基因后对C.pn感染诱导的VSMC粘附的影响；9.应用Transwell实验观察RNA干扰沉默IQGAP1表达后对C.pn感染诱导的VSMC迁移的影响。结果：1.C.pn感染组与正常对照组均应用Affymetrix Rat Genome2302.0Array,通过与大鼠31000个探针进行杂交,分析了31042个转录体和变异体,其中包括28000个己知基因。芯片杂交结果通过计算机扫描、定量和分析后,共发现差异表达基因35个,其中上调基因12个,下调基因23个；与细胞迁移密切相关的TLR2基因上调、TGF-B3和AKAP12基因下调。基因本体论分析结果显示,35个差异显著的基因中,30个基因可以在生物学过程、细胞组成和分子功能中找到注释,4个基因未搜索到其功能分类；代谢通路分析结果显示,7个基因参与细胞周期相关的信号通路、补体激活的经典途径相关信号通路、氧化应激相关信号通路和前列腺素合成调节相关信号通路；2.C.pn感染VSMC16h后,细胞粘附于Matrigel的能力明显增强。MTT比色结果显示,C.pn感染组的吸光度(Absorbance, A)值明显高于正常对照组(P<0.001)；Cpn感染组的细胞粘附率为162.342%±4.691%(P<0.001)；3.C.pn感染VSMC19h后,C.pn感染组的细胞迁移数目明显多于正常对照组(P<0.01)；细胞迁移指数为152.653%±7.493%(P<0.01)；4.C.pn感染VSMC2h后,IQGAP1(?)带亮度与正常对照组差别不大；随着感染时间延长,IQGAP1条带亮度逐渐增强；C.pn感染12h时IQGAP1条带亮度最强；之后,IQGAP1条带亮度又逐渐减弱,直至感染48h时,条带亮度与正常对照组基本相同；5. Western blot结果显示,C.pn感染VSMC后,随着感染时间延长,IQGAP1的表达水平也整体表现出先逐渐升高而后又逐渐降低的趋势；C.pn感染VSMC16h时IQGAP1的表达水平最高；随后,IQGAP1的表达水平又逐渐降低；6.重组质粒转染VSMC后24h,荧光显微镜下可观察到pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1Scrambled shRNA转染组(阴性对照组)和pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs转染组细胞均发出清晰的绿色荧光,而无质粒转染对照组和正常对照组细胞中则未见有绿色荧光；转染48h后,各组细胞中的绿色荧光较24h时增强；RT-PCR结果显示,无质粒转染对照组和阴性对照组细胞内IQGAP1mRNA表达水平与正常对照组无显著差异；而IQGAP1mRNA在pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNA转染组中的表达水平与正常对照组相比明显降低：7.经MTT比色后发现,pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs转染组的A值明显低于对照组(P<0.001),细胞粘附率为68.543%±1.197%(P<0.001)；阴性对照组细胞粘附于Matrigel的能力与正常对照组相比无明显变化(P>0.05)；C.pn感染转染pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs的VSMC后,该组的A值明显低于C.pn感染组(P<0.001),其细胞粘附率为104.991%±1.225%(P<0.001)；8.重组质粒pGPHl/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs转染VSMC后,细胞迁移数目明显低于正常对照组(P<0.01),细胞迁移指数为69.927%±4.838%(P<0.01)；阴性对照组细胞的迁移数目与正常对照组相比无明显差异(P>0.05)；C.pn感染转染pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs的VSMC后,该组细胞迁移数目明显低于C.pn感染组(P<0.01),细胞迁移指数为109.553%±4.401%(P<0.01)。结论：C.pn感染有可能通过上调TLR2基因并下调TGF-β3和AKAP12基因,促使VSMC迁移,进而参与动脉粥样硬化的发生发展；C.pn感染可促进VSMC粘附和迁移,其机制可能与其上调IQGAP1的表达水平,进而调控某些细胞迁移相关的信号通路有关。