一、研究目的我国心血管疾病的发病率居高不下,高脂血症、动脉粥样硬化、冠心病等疾病仍是我国居民生命健康的重大威胁。许多心血管疾病的发生发展以脂代谢紊乱为基础。大多数脂代谢紊乱相关疾病的研究使用经典的Apo E和LDLR敲除小鼠作为疾病模型。但是,小鼠模型存在着天然的缺点,一方面在处死动物了解疾病发展状况时无法排除处死过程中可能存在的一系列应激反应对实验结果的潜在影响,另一方面基因敲除和高脂饮食后无法在体实时观察与动脉粥样硬化发生发展关系密切的细胞的行为模式。另外,小鼠模型的构建耗时费力,不利于大规模应用。由于斑马鱼幼鱼具有周身透明、繁殖量大、成本低廉等优势,近年来逐渐成为心血管疾病研究的新型模式动物。本研究建立Apo Eb敲除斑马鱼脂代谢紊乱模型,为心血管疾病研究和调脂药物研发提供更多选择。二、研究方法(一)构建Apo Eb基因敲除斑马鱼系首先,通过荧光定量PCR和原位杂交对斑马鱼幼鱼早期发育过程中Apo Eb基因的表达模式进行初步了解。然后,针对已报道的Apo Eb基因序列设计了g RNA,体外转录合成了g RNA和Cas9蛋白m RNA,共同显微注射到1细胞期斑马鱼受精卵中,利用CRISPR/Cas9系统对Apo Eb基因进行大片段敲除。之后,通过基因型鉴定、荧光定量PCR检测m RNA表达等手段确定Apo Eb敲除效果,经过筛选、杂交等步骤最终获得了能够稳定遗传的Apo Eb基因敲除斑马鱼系。另外,对敲除体幼鱼早期血管发育进行了在体观察,以排除发育缺陷对后续实验结果的潜在干扰。(二)构建调脂药物筛选平台参照Apo E敲除小鼠脂代谢紊乱疾病模型构建方法和既往文献报道,予Apo Eb敲除斑马鱼幼鱼0.1%蛋黄液高脂饮食饲养2天,然后行油红O染色确定血管内脂质沉积效果。然后,以成品高脂干饲料喂养1.5月龄成鱼12周,在18周龄时离断尾部取血检测血浆脂质成分及含量;同时,将上述高脂饮食幼鱼收集,行全组织匀浆后检测匀浆液中脂质含量。接着,在所建立的脂代谢紊乱模型上行辛伐他汀药浴,通过油红O染色和组织匀浆脂质检测的方法观察辛伐他汀在斑马鱼幼鱼的效果和适宜浓度。(三)血脂康对动脉粥样硬化的预防作用在Tg(flk1:m Cherry;lyz:e GFP)转基因鱼系和野生型鱼系中按照前述方法构建调脂药物筛选平台,以辛伐他汀为阳性对照药物,通过油红O染色观测血管内脂质堆积情况,并通过荧光显微镜拍照观测同一条件下血管内中性粒细胞的行为模式,进而初步探索血脂康对中性粒细胞行为模式的影响及与脂代谢之间的关联性。三、实验结果(一)Apo Eb基因敲除斑马鱼系的建立构建了能稳定遗传的Apo Eb基因大片段缺失(Δ542 bp)斑马鱼系,且敲除体发育早期血管发育未见明显异常。(二)调脂药物筛选平台的构建通过Apo Eb敲除体幼鱼给予2天0.1%蛋黄液(蛋黄粉含有脂肪20%,胆固醇4%)、成鱼给予高脂干饲料(含脂肪24%,胆固醇5%)12周构建了表型明显、稳定的脂肪代谢紊乱模型。经过组织匀浆和血浆脂质成分检测,确定总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白胆固醇水平均有不同程度的上升。辛伐他汀药浴发现0.4μg/m L浓度下幼鱼生存率较好而降脂效果明显,可以用作后续研究中的阳性对照。(三)血脂康对动脉粥样硬化的预防作用血脂康药浴后血管内脂质堆积明显减轻,同时中性粒细胞在血管内的募集受到明显抑制,提示血脂康可能通过促进脂代谢和抑制中性粒细胞募集达到预防动脉粥样硬化,与他汀类药物的效果相似。四、结论1.Apo Eb敲除辅以高脂饮食可以构建斑马鱼的脂代谢紊乱疾病模型,可以用于大规模的调脂药物筛选和药理学、毒理学研究;2.血脂康通过促进脂代谢、抑制中性粒细胞在血管内募集,对动脉粥样硬化起预防作用。