目的:1.对比三组细胞（胃癌细胞株MGC-803、高转移性胃癌细胞株MGC-803-L、MGC-803-CLIC1-KO三组细胞）基因组的miRNA差异表达;2.对比高转移性胃癌细胞株MGC-803L、CLIC1基因稳定过表达细胞株MGC-803-LOE及CLIC1基因敲除细胞株MGC-803-CLIC1-KO三组细胞的外泌体miRNA差异表达。方法:1.课题组前期通过在裸鼠足底移植肿瘤细胞,在裸鼠腘窝淋巴结中反复提取淋巴结中的肿瘤细胞,建立侵袭、迁移能力显著高于亲本细胞的高转移性胃癌细胞株MGC-803-L。2.参照张锋的Human Ge CKOv2library查找CLIC1基因的sg RNA序列,将其构建于CRISPR/Cas9载体GV392质粒,并转染293T细胞,经Sanger测序确定DNA切割活性最高的sg RNA;采用有限稀释法将载体质粒转染MGC-803-L细胞并经puromycin筛选48h的细胞接种于96孔板,扩增培养得到单克隆细胞株;WB验证单克隆株CLIC1蛋白表达情况,将完全无表达的单克隆细胞株提取基因组DNA,Sanger测序及TA克隆分析敲除CLIC1的单克隆细胞的基因型,最终得到稳定敲除CLIC1基因的MGC-803-LKO细胞。3.MGC-803亲本细胞、高转移性胃癌细胞株MGC-803-L和MGC-803-KO三组细胞分别提取基因组用于miRNA测序并用RT-PCR验证差异表达的miRNA。4.将上述三组细胞扩大培养,加入支原体清除剂培养一周杀灭支原体,然后分别取细胞上清液100ml用超高速梯度离心法提取外泌体,外泌体用PBS 200ul溶解,冻存在-20℃冰箱中短暂保存;将外泌体分别提取miRNA用于miRNA测序并用RT-PCR验证差异表达的miRNA,并与细胞水平的miRNA结合研究。结果:1.经CRISPR/Cas9技术敲除CLIC1基因后,MGC-803-KO细胞与MGC-803-L细胞通过Western Blot检测结果表明CLIC1基因表达明显减少（p<0.001）。2.高转移性胃癌细胞株MGC-803-L、MGC-803L-CLIC1-KO两组细胞基因组的miRNA测序,对比MGC-803-L和MGC-803L-CLIC1-KO两组细胞的测序结果,共有69个差异表达的基因,挑选出表达量高的7个miRNA订制引物,细胞水平上验证miRNA表达差异是否与测序结果一致,结果挑选出2组miRNA,分别是hsa-miR-122-5p、hsa-miR-146a-5p。3.MGC-803、MGC-803-L、MGC-803L-CLIC1-KO三组细胞上清外泌miRNA测序,对比MGC-803-L和MGC-803L-CLIC1-KO两组细胞的测序结果,共发现有145个差异表达的miRNA,挑选表达量高且差异大的15个miRNA进行验证（hsa-miR-100-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-1304-3p）订制miRNA引物,提取细胞上清外泌体,通过RT-PCR验证上述miRNA的趋势,结果显示有4组miRNA的表达趋势与测序的结果相一致,分别是:hsa-miR-22-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146-5p。4.结合细胞水平及外泌体水平的miRNA测序结果,对差异表达的miRNA进一步研究。结论:1.成功构建CLIC1敲除的高转移细胞株MGC-803-L,为进一步研究CLIC1基因在胃癌中的作用及机制奠定基础。2.hsa-miR-22-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146-5p有可能成为胃癌细胞的潜在标志物。