近些年来,褪黑素及其同分异构体对人体的许多重要生理调节作用受到广泛关注,而且它在葡萄酒等发酵饮品中的一些功能也被作为新发现引起重视。但目前葡萄酒等果酒中褪黑素及其同分异构体的来源、变化机制和影响因素尚未见研究报告。本研究以桑椹酒和葡萄酒为研究材料,优化了一种褪黑素及其同分异构体的检测方法,并系统研究了从果实发育到果酒发酵全过程中褪黑素及其同分异构体的变化规律和机制,同时探讨了褪黑素与酿酒酵母之间的相互作用关系和酿酒酵母合成褪黑素及其同分异构体的重要条件。主要的研究结果如下:1、本研究优化了果实果酒中褪黑素及其同分异构体的最佳提取工艺,并建立了准确可靠的HPLC-ESI-MS的检测方法,该方法褪黑素的最低检出限达到0.01 ng/mL,最低定量限为0.1 ng/mL,加标回收率均在85%以上,相对标准偏差在10%以内,比现有方法有了明显提高。2、酿酒葡萄和桑椹果实及果酒中都含有褪黑素,果酒中褪黑素含量远高于果实中的含量。葡萄酒中褪黑素含量最高为24.48ng/mL,葡萄果实中褪黑素含量最高为8.18ng/g FW。葡萄和葡萄酒中褪黑素含量高于桑椹和桑椹酒约1倍。在本试验所用的桑椹和葡萄品种中,果实中未检测到同分异构体,但在果酒中却被大量检出,似乎表明,同分异构体只有经过发酵后才能生成。红色品种的果实及果酒其褪黑素和同分异构体含量要多于白色品种;两年的试验中,发现不同产地来源的果实和果酒,褪黑素的含量明显不同。3、桑椹果实在发育过程中褪黑素含量以幼果期(坐果后10天)含量最高,以后逐渐降低,而酿酒葡萄果实却不同,幼果期含量较低,而在果实发育的第60天有一个明显的褪黑素合成高峰,达到最高,以后也逐渐降低。TDC(色氨酸脱羧酶)是果实褪黑素合成其中的一个关键基因,其相对表达量变化同褪黑素含量的变化基本一致。褪黑素含量变化趋势同果实中丙二醛(MDA)含量变化趋势呈现负相关,暗示褪黑素可能影响果实的抗氧化体系。成熟的赤霞珠果实在紫外处理1h后,褪黑素含量迅速上升,约为对照组的2.44倍,且保持稳定,显示紫外胁迫可以诱导果实褪黑素的生物合成。4、在桑椹酒和葡萄酒发酵过程中,褪黑素在发酵初期(第1-3天)大量合成,随后降低,而褪黑素同分异构体则逐渐累积,在发酵中期(第7-10天)达到最大值,直到发酵结束保持稳定。5、scAANAT是酿酒酵母褪黑素合成的一个关键基因,其相对表达量与褪黑素变化也表现一致。在普通培养基YPD中,没有检测到酿酒酵母合成褪黑素,而在模拟培养基MSM中,褪黑素及其同分异构体却被明显检出,但含量远小于真实果酒中。试验表明,商业酵母菌株AWRI R2(Saccharomyces cerevisiae,简称 A)和 Freddo(Saccharomyces cerevisiae,简称 F)褪黑素及其同分异构体合成能力要显著高于野生酵母菌株BH8(Saccharommyces cerevisiae,简称B)。一定浓度的外源褪黑素(100 ng/mL)处理能增强MSM培养条件下酿酒酵母的抗氧化能力。6、在普通培养基YPD中,外源光照和色氨酸处理,没有检测出酿酒酵母合成褪黑素,但是在普通培养基YPD和模拟培养基MSM中,逆境胁迫处理却明显检测出酿酒酵母诱导合成的褪黑素。在MSM培养基中,高铜胁迫也能诱导增加菌株A褪黑素的生成量,且比对照组增加5倍,低pH胁迫也能显著增加菌株A褪黑素同分异构体的生成量,相比于对照组也增加76%。综合本研究的结果,作者提出以下假说:褪黑素的形成,是在逆境条件下诱导产生的,与植物果实不同,微生物酿酒酵母在逆境条件下,不仅可以被诱导产生褪黑素,也可以被诱导产生褪黑素的同分异构体,因此,果酒中褪黑素和其同分异构体主要来源于酿酒酵母的发酵过程。