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目前已有大量的植物DNA病毒与正链RNA病毒被改造为表达载体和基因沉默载体,而植物负链RNA病毒反向遗传学体系建立不久,仅少数几种负链RNA病毒被改造为表达载体。研究表明,由于基因组结构、粒子形态和复制方式等方面的特性,负链RNA病毒载体具有包容能力强、插入外源片段稳定等优点。苦苣菜黄网病毒(Sonchus yellow net virus,SYNV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)细胞核弹状病毒属(Nucleorhabdovirus),是第一个通过反向遗传学拯救的植物负链RNA病毒。本研究以前期建立的SYNV侵染性克隆为基础,构建了表达Cas12a(Cpf1)和CRISPR RNA(cr RNA)的基因组编辑载体,实现了序列特异性Cas12a核酸内切酶的无转基因递送及高效的植物基因组编辑。此外,构建了一系列基于SYNV的病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体、人工micro RNA(ami RNA)载体、mi RNA沉默载体等,并研究了这些载体的特性。这些结果拓展了负链RNA弹状病毒载体的应用范围,为植物功能基因组研究提供了新的工具。一、基于SYNV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建和分析将毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)Cas12a和cr RNA作为两个独立转录单元插入到SYNV的leader与N基因之间,构建了SYNV基因组编辑载体。利用此载体对16c转基因本氏烟中GFP基因和本氏烟内源PDS基因进行了编辑,编辑效率分别达到88%和84%以上;根据Cas12a对自身cr RNA前体自我加工的特性,构建了同时表达2个cr RNA的多靶标编辑载体,可以在两个靶点位点都产生高效编辑;采取本氏烟发病系统叶片在无抗性的培养基上进行组培再生,获得PDS四个等位基因全部被编辑且不含有外源DNA的非转基因编辑植株,且编辑的基因可稳定遗传。二、利用SYNV CRISPR/Cas12a编辑载体对本氏烟进行糖基化工程改造应用植物表达平台生产的抗体都含有植物特异的β-1,2-木糖和α-1,3-岩藻糖残基,分别由β-1,2-木糖转移酶(β-1,2-xylosyltransferase,Xyl T)和α-1,3-岩藻糖转移酶(α-1,3-fucosyltransferase,Fuc T)催化。这两种植物特异性残基在哺乳动物体内具有免疫原性,并可导致抗体的半衰期下降。利用SYNV CRISPR/Cas12a基因组编辑载体,对本氏烟N-糖基化途径进行了分步改造。首先,敲除了本氏烟中两个β-1,2-木糖转移酶(Xyl T)基因和两个α-1,3-岩藻糖转移酶(Fuc T)基因;而后,进一步敲除了剩下的两个Fuc T基因,获得了Xyl T和Fuc T基因全部失活的非转基因本氏烟。利用糖链特异性抗体检测发现,突变体植株完全不含有β-1,2-木糖和α-1,3-岩藻糖。三、基于SYNV的基因沉默载体与micro RNA沉默载体的构建和分析(1)VIGS载体。将GFP基因片段以正向、反向或发夹结构置于病毒N/P基因间隔区下游,以一个独立转录单元的方式插入SYNV基因组中,构建了SYNV VIGS载体。三种载体均可有效沉默16c转基因本氏烟中GFP基因,但发结构插入载体沉默效率最高,反向插入其次,而正向插入最低。以相似的方法构建了靶向本氏烟中内源PDS基因的SYNV沉默载体,发现除发夹结构插入载体外,正向和反向插入载体均无法产生高效沉默。这些结果表明,负链RNA弹状病毒无法产生足够的双链RNA结构,其VIGS载体需表达发夹结构才能诱发有效的RNA沉默。(2)ami RNA表达载体。SYNV在细胞核内复制和转录,产生具有5’帽子和3’Poly(A)结构的病毒m RNA。利用该特性,以拟南芥mi R319前体为骨架,将其中成熟的mi RNA及其互补序列替换为PDS基因靶标序列,以一个独立转录单元的方式插入SYNV基因组中,构建了SYNV ami RNA载体。接种本氏烟后,该载体可引起植株系统白化表型,其沉默效率与携带发夹结构的SYNV VIGS载体沉默效率相当,表明SYNV表达ami RNA可产生高效和特异的基因沉默。(3)mi RNA沉默载体。设计了可结合本氏烟mi R165/166的短串联靶标模拟(STTM)序列,并以一个独立转录单元的方式插入SYNV基因组中,构建了SYNV mi RNA沉默载体。接种本氏烟后,发病植株中mi R165/166水平下调了5.2倍,对应的靶标m RNA水平上升了4.3倍,植株出现了mi R165/166缺失相关的特征性表型,表明该载体可显著沉默mi RNA的表达。(4)同时表达蛋白和基因沉默载体。将GUS基因和GFP发夹结构分别作为独立转录单元插入SYNV基因组中,构建了SYNV-GUS-hp GPF载体。该载体可系统侵染本氏烟,在过量表达GUS蛋白同时沉默16c转基因本氏烟中GFP基因。综上所述,SYNV模块化的基因组结构特征,以及良好的基因组稳定性和外源片段包容能力,为载体构建提供了便利。通过表达长度大于4 Kb的Cas12a和cr RNA,实现了对本氏烟单个和多个基因的高效编辑,发病植株叶片组培再生后获得了非转基因编辑植株。与传统的转基因编辑的方法相比,此方法更加高效、便捷,且无需去除选择性标记基因和Cas转基因。此外,SYNV还可以改造成为多用途的VIGS载体、ami RNA表达载体、mi RNA沉默载体,并可同时进行蛋白表达和基因沉默,这些应用为植物功能基因组学提供了多种技术手段,也为其它类似植物弹状病毒载体构建提供了借鉴。