【摘 要】
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第一部分目的探讨lncTUG1通过调控柯萨奇病毒（Coxsackievirus B3,CVB3）诱导的心肌细胞焦亡在病毒性心肌炎（Viral myocarditis,VMC）发生发展中的作用,初步阐明其可能的分子机制。方法Balb/c小鼠腹腔注射CVB3构建VMC模型;在构建模型过程中,观察并记录小鼠体重、精神状态、以及存活率;取VMC模型组及对照组小鼠心肌组织,进行组织切片,HE染色,观察小鼠心
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第一部分目的探讨lncTUG1通过调控柯萨奇病毒（Coxsackievirus B3,CVB3）诱导的心肌细胞焦亡在病毒性心肌炎（Viral myocarditis,VMC）发生发展中的作用,初步阐明其可能的分子机制。方法Balb/c小鼠腹腔注射CVB3构建VMC模型;在构建模型过程中,观察并记录小鼠体重、精神状态、以及存活率;取VMC模型组及对照组小鼠心肌组织,进行组织切片,HE染色,观察小鼠心脏组织炎症情况;通过超声心动图检测VMC模型小鼠心功能的变化;取VMC模型组与对照组心肌组织,提取总RNA,RT-q PCR检测病毒结构蛋白VP1及lncTUG1的表达;眼眶取血,ELISA检测模型鼠及对照鼠血液循环中白介素-1β的水平;提取心肌组织总蛋白,western blot检测细胞焦亡相关蛋白caspase-1,GSDMD,ASC的表达。同时,用CVB3感染小鼠心肌细胞（HL-1）构建病毒性心肌炎的细胞模型;提取受染细胞RNA,RT-q PCR检测病毒VP1基因及lncTUG1的表达;合成lncTUG1的si RNA敲低细胞内lncTUG1的表达,运用western blot技术检测细胞焦亡相关蛋白的变化;采用生物信息学技术手段及文献分析寻找lncTUG1的下游靶基因并验证。结果组织切片HE染色显示腹腔注射CVB3可以诱发balb/c小鼠心脏组织炎症,提示VMC小鼠模型构建成功;与对照组小鼠相较,VMC组小鼠体重及存活率均明显下降;超声心动图提示VMC组小鼠心功能受损,表现为心输出量和每搏输出量显著下降;血清ELISA结果表明,VMC小鼠血清中IL-1β显著升高;此外,RT-q PCR结果提示,VMC组小鼠心肌组织可检测到CVB3结构基因VP1的表达,且lncTUG1的表达水平在VMC小鼠心肌组织中显著升高;western blot结果提示VMC小鼠的心肌组织中焦亡相关蛋白表达水平显著升高。在CVB3感染的HL-1细胞中,RT-q PCR可检测到VP1及lncTUG1的高表达;不仅如此,western blot结果提示细胞在感染了CVB3后,细胞内焦亡相关蛋白的表达水平也相应升高,这提示CVB3可诱导HL-1细胞焦亡发生。当我们用lncTUG1的si RNA下调细胞内lncTUG1的表达水平后,可以逆转CVB3诱导的HL-1细胞焦亡。通过生物信息学手段及RT-q PCR初步确定lncTUG1的靶基因miR-26a;通过合成miR-26a的mimics来调节细胞内miR-26a的表达水平后,也可以逆转CVB3诱导的HL-1细胞焦亡,这表明在本研究中miR-26a可能作为lncTUG1的靶基因参与到CVB3诱导的细胞焦亡中。结论本研究结果表明,CVB3诱导的心肌细胞焦亡增加可能是导致VMC发生发展的机制之一,且CVB3是通过lncTUG1-miR-26a轴来诱导心肌细胞焦亡发生的。第二部分目的初步探讨在逆转录病毒蛋白酶抑制剂诱导血管内皮细胞老化中lncTUG1可能发挥的作用机制。方法使用逆转录病毒蛋白酶抑制剂利托那韦（Ritonavir）和洛匹那韦（Lopinavir）处理小鼠主动脉内皮细胞（Mouse aortic endothelial cells,MAEC）构建细胞老化模型;SA-β-GAL染色检测细胞老化情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;通过RT-q PCR检测lncTUG1的表达水平;构建lncTUG1过表达腺病毒调控细胞内lncTUG1的表达水平,再检测细胞老化及凋亡的变化情况。结果SA-β-GAL染色结果表明逆转录病毒蛋白酶抑制剂Lopinavir和Ritonavir均可诱导小鼠血管内皮细胞出现老化,且联合用药组（Lopinavir/r）诱导细胞老化最为明显;流式细胞仪检测细胞凋亡情况与细胞老化结果相一致;与此同时,RT-q PCR结果提示在药物诱导细胞老化模型中lncTUG1的表达水平显著下降,当通过过表达腺病毒转染MAEC细胞上调lncTUG1的表达后,我们发现上调lncTUG1的表达可以抑制逆转录病毒蛋白酶抑制剂诱导的MAEC细胞老化及凋亡。结论LncTUG1或是通过调控细胞凋亡参与到逆转录病毒蛋白酶抑制剂诱导的细胞老化过程中。
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