前言:　　 有机粉尘是指在空气中漂浮的有机物颗粒,包括植物、动物和微生物源性的颗粒和微滴。在自然界尤其是生产加工过程中广泛受到有机粉尘的污染。细菌或真菌及其产生的内毒素、1-3-β-葡聚糖、真菌孢子、动物蛋白等可以引起许多呼吸道炎症或过敏性疾病,如职业性变态反应性肺泡炎(occupationalal lergic alveolitis)、有机粉尘毒性综合征等。职业性变态反应性肺泡炎是由于吸入被真菌、细菌或动物蛋白污染的有机粉尘而引起的间质肉芽肿性肺炎,也称过敏性肺炎。真菌是主要致病因子之一。1-3-β-葡聚糖是真菌细胞壁的主要结构,作为研究真菌致病性的标志物。　　 细胞因子(cytokine)由多种细胞分泌,相互促进或相互抑制,发挥重要的调节作用。1-3-β-葡聚糖与吞噬细胞膜表面受体结合,引起细胞因子的分泌。　　 Th1和Th2细胞都有其特有的细胞因子。白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)与γ-干扰素(［γ-interferon,IFN-γ)是代表性的Th1型细胞因子。白细胞介素4(interleukin4,IL-4)是代表性的Th2型细胞因子。国内外研究发现1-3-β-葡聚糖可以影响Th1型免疫应答。如1-3-β-葡聚糖可促进IFN-γ上调TNF-α,IL-6和IL-1βmRNAs的表达和分泌。1-3-β-葡聚糖也可影响Th2型免疫应答。Th1和Th2型细胞因子发挥不同作用,以致对机体产生不同的功能影响。1-3-β-葡聚糖可能是通过诱导白细胞介素10(interleukin10,IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β)的表达或分泌抑制Th1型免疫应答。　　 为研究1-3-β-葡聚糖对Th型细胞因子分泌的影响,本实验同时分离并体外共同培养肺泡巨噬细胞和脾淋巴细胞。RealtimeRT-PCR检测调节性淋巴细胞标志物Foxp3mRNA表达水平观察是否诱导淋巴细胞分化,从而调节细胞因子分泌情况。采用EIASA方法测上清液中Th型细胞因子及抑制性因子的分泌情况。　　 实验方法:　　 一、小鼠1-3-β-葡聚糖体内灌注　　 C57BL/6小鼠(6-8w龄,雌性)应用非暴露式气管灌注0.1ml1-3-β-葡聚糖(3mg/ml)或0.1mlPBS建立C57BL/6小鼠肺部炎症模型组和阴性对照组。　　 二、巨噬细胞和淋巴细胞的分离　　 气管灌注7天后处死模型组和对照组小鼠。将肺脏从小鼠体内游离并得到肺泡灌洗液(Broncho alveolarlavagefluid,BALF),BALF1500r/min,4℃,离心10分钟,收集细胞悬液,取10ul细胞悬液至于细胞计数板上,进行细胞计数。细胞数=(四个大格的细胞总数/4)×104。用含有10%胎牛血清的RPMI-1640将细胞浓度调整到1×105/ml。用24孔板进行细胞培养。对照组及模型组小鼠的BALF细胞各加1ml到4个培养孔。24孔板置于37℃,5%CO2培养箱。贴壁培养2小时,RPMI-1640清除未贴壁细胞,得到纯度较高的巨噬细胞。将脾脏从小鼠体内游离,放置到35mm培养皿中加淋巴细胞分离液研磨。收集细胞于离心管,加200-500μlRPMI-1640。2000r/min,4℃离心30分钟。吸取淋巴细胞于新的离心管并加培养基离心洗涤并重悬。取10ul细胞悬液于细胞计数板上,进行细胞计数,将细胞浓度调整到5×106/ml备用。　　 三、体外共培养　　 对照组、模型组巨噬细胞及对照组、模型组淋巴细胞体外分别混合培养,细胞置于24孔板加体外刺激因素1-3-β-葡聚糖(100μg/ml)或PBS。1-4组为:MG-LG-G-;MG-LG-G+;MG-LG+G-;MG-LG+G+。5-8组为:MG+LG-G-;MG+LG-G+;MG+LG+G-;MG+LG+G+。MG-指对照组巨噬细胞;MG+指模型组巨噬细胞;LG-指对照组淋巴细胞;LG+指模型组淋巴细胞;G-指体外PBS;G+指体外1-3-β-葡聚糖。每组加入伴刀豆蛋白刺激生长。放入细胞培养箱中培养24小时和48小时。　　 四、提取RNA及检测Foxp3表达水平　　 于共培养细胞中分离出淋巴细胞,加1mlTrizol试剂,离心静置,加氯仿离心,转移新管加异丙醇,并加入4℃预冷的75%7,醇,离心加RNase-free水溶解总RNA,测浓度并调整至1μg/μl。参照TaKaRa公司的逆转录酶操作说明书,将RNA逆转录成cDNA,之后配制PCR反应液于ABI7500仪器进行40个循环。相对定量法计算各组淋巴细胞目标基因FoXp3mRNA相对表达量。　　 五、ELISA检测Th1型、Th2型及抑制性细胞因子的分泌　　 在ELISA试剂板中每孔加入100μl包被抗体,冰箱4℃过夜。次日,弃液洗涤。每孔加200μl检测缓冲液室温孵育1小时。加一定稀释的待检样品及标准品100μl于上已述包被反应孔,置37℃孵育2小时。洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。于各反应孔加100μl检测抗体室温孵育1小时,洗涤。室温加100μl检测酶孵育30分钟。100μl底物显色15分钟左右。于各反应孔中加50μl反应终止液。可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅。于450nm处,ELISA酶标仪以空白对照孔调零后测各孔OD值。　　 六、数据统计分析　　 此实验独立重复五次(n=5)。全部数据采用SPSS16.0统计学软件进行分析,统计结果表示为均数±标准误。采用单因素方差分析比较各组间统计学差异,当差异有统计学意义时,用LSD或SNK法进行两两比较,P<0.05具有统计学意义。　　 实验结果:　　 一、1-3-β-葡聚糖诱导体外培养淋巴细胞Foxp3mRNA表达　　 培养48h,1-3-β-葡聚糖体外刺激诱导体外共培养细胞中的淋巴细胞Foxp3mRNA表达。Foxp3是调节性淋巴细胞的特征性标志,在巨噬细胞与淋巴细胞共培养条件下,1-3-β-葡聚糖体外刺激可能诱导Foxp3mRNA表达。　　 二、1-3-β-葡聚糖抑制体外共培养细胞Th1型细胞因子的分泌　　 体外1-3-β-葡聚糖刺激抑制共培养细胞分泌IL-2。培养24h,体内刺激的淋巴细胞分泌较多的IL-2。但培养48h,体外1-3-β-葡聚糖刺激对IL-2分泌的抑制作用比淋巴细胞活化作用更为明显。综合观察巨噬细胞未刺激组和巨噬细胞刺激组IL-2细胞因子浓度,趋势一致,表明巨噬细胞是否活化对IL-2分泌无明显影响。　　 体外1-3-β-葡聚糖刺激对IFN-γ的分泌影响不明显。淋巴细胞刺激作用较明显。培养24h,体内刺激的淋巴细胞分泌较多的IFN-γ。且培养48h,体外培养刺激巨噬细胞及刺激淋巴细胞分泌浓度更高的IFN-γ。综合观察巨噬细胞未刺激组和巨噬细胞刺激组IFN-γ细胞因子浓度,趋势并不完全一致,表明与IL-2不同,巨噬细胞刺激可能影响IFN-γ分泌。　　 三、1-3-β-葡聚糖促进体外共培养细胞Th2型细胞因子的分泌　　 体外1-3-β-葡聚糖刺激促进共培养细胞分泌IL-4。培养24h,体内刺激的淋巴细胞分泌较多的IL-4。培养48h后,体内刺激的淋巴细胞也显示了促进IL-4分泌作用。综合观察巨噬细胞未刺激组和巨噬细胞刺激组IL-4细胞因子浓度,趋势基本一致,表明巨噬细胞是否刺激对IL-4分泌作用不明显。　　 四、1-3-β-葡聚糖促进体外共培养细胞抑制性细胞因子的分泌　　 体外1-3-β-葡聚糖刺激诱导共培养细胞分泌IL-10。淋巴细胞体内刺激也促进了IL-10分泌。综合观察巨噬细胞未刺激组和巨噬细胞刺激组IL-10细胞因子浓度,趋势一致,表明巨噬细胞是否刺激对IL-10分泌无明显作用。　　 体外1-3-β-葡聚糖刺激诱导共培养细胞分泌TGF-β。淋巴细胞的体内刺激对TGF-β的分泌有一定促进作用。综合观察巨噬细胞未刺激组和巨噬细胞刺激组TGF-β细胞因子浓度,趋势一致,表明巨噬细胞是否刺激对TGF-β分泌无影响。　　 结论:　　 1、1-3-β-葡聚糖抑制体外共培养细胞Th1型细胞因子的分泌。　　 2、1-3-β-葡聚糖促进体外共培养细胞Th2型细胞因子的分泌。　　 3、1-3-β-葡聚糖促进体外共培养细胞抑制性细胞因子的分泌。