论文部分内容阅读
菜籽粕是压榨生产菜籽油的副产物,富含优质的植物蛋白,其水解产物菜籽多肽具有抗氧化、抑制肿瘤细胞生长以及降血压等功效。目前,菜籽多肽的制备一般使用蛋白酶水解或中温微生物发酵法,但是,酶制剂价格昂贵,中温发酵需要消耗大量蒸汽资源对发酵底物与设备进行彻底灭菌,同时菜籽蛋白经高温高压灭菌易变性,在一定程度上影响了菜籽蛋白的转化效率。利用高温蛋白酶产生菌对菜籽粕高温固态发酵,能有效抑制发酵基质中嗜温污染微生物的生长,可实现不灭菌底物直接发酵,大幅度降低成本,同时增加底物利用率、提高菜籽多肽产量。本论文首先从菜籽粕中筛选出能高效水解菜籽蛋白的高温菌,通过对微生物群落结构的分析,以验证高温固态发酵未灭菌菜籽粕制备多肽的可行性;采用常压室温等离子体（Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP）诱变筛出菌以提高蛋白酶活力,并利用响应面法优化固态发酵未灭菌菜籽粕制备多肽的工艺参数;最后运用基因组重测序技术初步探究ARTP诱变出发菌高产高温蛋白酶潜在机制。本文的主要研究内容及结果如下:（1）通过比较高温与中温固态发酵未灭菌菜籽粕底物中菌落总数的差异,初步探究高温发酵的可行性,结果表明高温发酵可显著减少基质中嗜温微生物的生物量。采用水解圈初筛与蛋白酶活力复筛的方法,成功从菜籽粕中筛选出一株产高温蛋白酶菌株,命名为RM-2,其蛋白酶活力可达25.50 U/mL,经16S rRNA基因测序,表明菌株RM-2属于嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）。（2）利用高通量测序技术分析了不同条件固态发酵未灭菌菜籽粕基质中的细菌群落组成与丰度,进一步验证高温发酵的可行性,并确定发酵优势菌种。Alpha-多样性分析结果显示,高温固态发酵未灭菌菜籽粕相比中温发酵,基质中的操作归类单元（Operational Taxonomic Units,OTU）减少了37.5%,且高温发酵优势菌种为土（地）芽孢杆菌属（Geobacillus）,其相对丰度为72.83%;经Beta-多样性分析,组间样本存在较大差异,对高温发酵组产生显著性影响的物种为地芽孢杆菌属（Geobacillus）。（3）以嗜热脂肪地芽孢杆菌为出发菌,利用常压室温等离子体进行诱变,筛选出高产高温蛋白酶突变菌。结果表明,在通气量为10 SLM（标况下升每分钟,Standard Litre per Minute）、功率为100 W、诱变时间为5 s的条件下,ARTP诱变致死率可达90.5%,并在此条件下以水解圈直径与菌落直径之比（K值）为初筛指标、蛋白酶活力为复筛指标,筛选出一株产酶活力较高且能稳定遗传的突变菌株A75,其蛋白酶活力达到32.09 U/mL,相对于出发菌株提高了25.62%。（4）通过响应面法优化了突变菌株A75高温固态发酵未灭菌菜籽粕制备多肽的工艺参数。结果发现在每20 g不含水发酵基质中接种107 CFU菌量、发酵时间65 h、料液比1:1.6（g/mL）、发酵温度55℃、麸皮添加量20%（W/W）、MgSO4添加量0.1%（W/W）的条件下,菜籽多肽得率达到最大值6.78%,且小分子蛋白组分与总氨基酸含量较未发酵组均有所提高,分别提高了15.17%和16.47%。（5）初步探究ARTP诱变嗜热脂肪地芽孢杆菌机制。通过扫描电镜发现相对于出发菌株RM-2,突变菌株A75的菌体变为短杆状;利用基因组重测序技术,发现突变菌株A75共发生了343处单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）非同义突变位点,涉及的基因有121个,将差异基因编码的氨基酸序列分别在GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、eggNOG（evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups）数据库中进行比对,发现有较多的差异基因参与氨基酸的转运与代谢、碳水化合物的代谢、细胞膜和细胞壁的组成以及氮化合物的代谢等过程中,说明ARTP诱变仪处理嗜热脂肪地芽孢杆菌时,活性粒子可能穿透了细胞膜,使细胞内的遗传物质发生变化,从而影响了菌体蛋白酶的表达。