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背景和目的 胎盘滋养细胞的浸润是细胞－细胞、细胞－基质间相互作用的机能变化。这一过程发生细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)成分的变化，受到细胞因子、生长因子、粘附分子、蛋白酶类和激素等多种因素的调控。leptin是新近发现参与着床调控的细胞因子，可能通过改变细胞滋养细胞(Cytotrophoblast，CTB)整合素的表达，刺激癌胚型纤维粘连蛋白(onco-fetal－fibronectin,onfFN)的合成，增加基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)的分泌而起作用。FN是ECM的主要成分之一，作为整合素的配体参与CTB的浸润，启动了MMPs的分泌。Leptin与FN间是否有某种关联，协同调控滋养细胞的浸润从而影响胚胎着床还未见文献报道。因此，本实验在改进分离培养人早孕绒毛CTB并观测其体外培养时部分生物学特性的基础上，应用被覆matrigel的侵袭模型研究leptin和FN是否协同影响滋养细胞的浸润，并对其机制进一步探索，为明确着床机理提供有用线索。方法 第一部分：人早孕绒毛CTB的分离培养及部分生物学特性的实验研究。采用酶消化、Ficoll密度梯度离心和差速贴壁综合优化法对早孕绒毛CTB进行分离、纯化及培养；光电镜、免疫组化图像分析、苔盼蓝排出实验进行细胞鉴定及纯度、活力分析；应用MTT、ELESA、荧光标记示踪、细胞周期测定分别进行细胞生长曲线、激素分泌、细胞形态分化、细胞周期的测定观察其体外培养时部分生物学特性。第二部分：Leptin协同FN影响CTB的浸润特性。应用RT-PCR技术测定培养的早孕绒毛滋养细胞leptin mRNA表达；应用被覆matrigel的体外侵袭模型transwell观测leptin干预前后及添加FN前后CTB浸润能力的变化。第三部分：leptin和FN对CTB分泌MMPs的影响。应用明胶酶谱法分析CTB培养液中MMPs的分泌情况。结果 第一部分：分离培养的CTB大多为幼稚未分化细胞，细胞纯度91％，活力达96.5％，79％处于G0/G1期，由单个核向多核、巨核细胞定向分化。随着CTB形态分化，激素开始合成并随其功能、形态的变化而变化，呈一定的曲线。第二部分：1.早期妊娠绒毛滋养细胞表达leptin mRNA，转录量为1.8129±0.481<WP=9>attomoles/ug总RNA ，在235bp处条带表达。2. 在CTB侵袭试验中，向transwell下室添加50ug/ml FN使浸润穿过matrigel及PET膜(以下简称穿过膜)的细胞数明显多于对照组，P<0.05。3. leptin各不同浓度组浸润穿过膜的细胞数均显著多于对照组，P<0.05。其中Leptin100ng/ml时，浸润穿膜的细胞数增加最显著，P<0.01；而Leptin10与500ng/ml组影响作用相当， P>0.05。4.不同浓度leptin与50ug/mlFN协同时，浸润穿膜的细胞数显著多于对照组，P<0.01，比单一FN组和单一leptin各对应浓度组浸润穿膜的细胞数也增加，P<0.05。协同组中， Leptin100ng/ml影响穿膜细胞数最显著，P<0.01；但10与500ng/ml浓度组间无差异，P>0.05。第三部分：明胶酶谱显示，除对照组中未测出MMP-9外，其余各组中均有MMP-2,9分泌。在82kD (代表MMP-9) 、67kD(代表MMP-2) 位置有酶降解带。CTB分泌的MMP-2比MMP-9多，有非常显著的差异，P<0.01。其中，协同组分泌MMP-2显著多于FN组和对照组，P<0.01；协同组中leptin100ng/ml浓度组MMP-2 分泌最多，P<0.05，而leptin10ng/ml与500ng/ml协同组间无差异，P>0.05。协同各组MMP-9的分泌均显著多于FN组，P<0.01。结论 1.成功改善分离培养人早孕绒毛CTB方法，简便易行，获得的细胞纯度高、活力强为进一步研究CTB在生殖生理中的作用提供了实验基础。2.早孕绒毛滋养细胞表达leptin mRNA，提示leptin可能在胚胎着床过程中起某种作用。3.不同浓度leptin干预CTB，均使其侵袭能力增强。在leptin100ng/ml时CTB浸润能力最强，在10、500ng/ml时，侵袭能力相对较弱。这可能正是滋养细胞侵袭有限性的表现。4.FN诱导能使滋养细胞浸润能力增强，可能是FN－整合素结合启动了滋养细胞的浸润过程。5. 首次发现当leptin与FN协同时，能增强CTB浸润能力，比任一单一因素的影响更为显著。本实验中，在leptin为100ng/ml浓度时，协同作用最强。从这点上更能说明滋养细胞的浸润过程受细胞与细胞、细胞与基质共同作用的多因素调控。6.从生化方面更进一步证明了leptin与FN协同作用于CTB影响其分泌MMPs，从而调控CTB的浸润能力。