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目的(一)利用乳鼠和成年小鼠综合评价马兜铃酸I(aristolochic acid I,AAI)的毒性差异,为马兜铃酸临床辩证用药,安全合理应用提供一定的科学依据。(二)利用乳鼠和成年小鼠综合评价AAI和马兜铃内酰胺(aristololactam,AAT)在不同年龄体内的代谢差异,科学阐释马兜铃酸在不同年龄段内造成毒性差异的原因。(三)评价以当归芍药散为组方基础的院内方剂活血化瘀方对AAI所致成年小鼠肝、肾毒性的治疗作用,为临床误服马兜铃酸相关制剂的患者提供科学有效的治疗手段。方法(一)利用乳鼠和成年小鼠评价AAI毒性研究。研究分为乳鼠正常对照组,乳鼠AAI 2.5 mg/kg组,乳鼠AAI 5 mg/kg组,成年小鼠正常对照组,成年小鼠AAI 2.2 mg/kg组,成年小鼠AAI 4.4 mg/kg组,每组15只,连续给药5天。观察AAI致乳鼠和成年小鼠的死亡情况;收集血清进行肝脏、肾脏和心脏功能指标检测;采集肝脏、肾脏和心脏组织样本进行HE染色,比较脏器损伤差异。(二)AAI和AAT在乳鼠和成年小鼠体内代谢差异研究。研究分为乳鼠正常对照组,乳鼠AAI 22.9 mg/kg组,成年小鼠正常对照组,成年小鼠AAI 20 mg/kg组,腹腔注射AAI溶液一次。实验开始后第2、4、6、8、10、12和24小时眼球取血,并在对应时间点收取尿液,每个时间点乳鼠和成年小鼠每组3只。采用lc-ms/ms检测方法,检测AAI和AAT在乳鼠和成年小鼠血和尿中的浓度差异,进一步解释AAI导致不同年龄段小鼠毒性差异的原因,并为临床治疗因服用含AAI相关制剂诱发的疾病提供相应的科学依据。(三)评价活血化瘀方对AAI致成年小鼠肝、肾毒性的治疗作用研究。将成年小鼠随机分为4组,每组10只:对照组,模型组,活血化瘀方低剂量组、活血化瘀方高剂量组,模型组腹腔注射AAI 4.4 mg/kg,连续给药5天,低剂量组,高剂量组分别灌胃7.5 g/kg、15 g/kg的活血化瘀方,连续给药14天,实验过程中观察实验动物整体情况;收集血清进行肝脏和肾脏功能指标检测;采集肝脏和肾脏组织样本进行HE染色,比较脏器损伤差异。结果(一)利用乳鼠和成年小鼠评价AAI毒性研究。实验动物死亡情况:成年小鼠AAI 2.2 mg/kg组第8天出现死亡,最终死亡率为53.3%,成年小鼠AAI 4.4mg/kg组第6天出现死亡,最终死亡率为100%,而乳鼠组均未发生死亡。血清学检测结果显示,与正常对照组相比,AAI 2.2 mg/kg组、AAI 4.4 mg/kg组成年小鼠肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)均显著升高,且AAI 4.4 mg/kg组高于AAI 2.2 mg/kg组(p<0.05),其中Cr和BUN升高最为显著,但乳鼠组各项指标均未明显改变;HE染色结果显示,AAI可导致成年小鼠急性肾小管坏死,肾小管和间质显著扩张;肝小叶部分细胞核溶解和核破碎;心肌淤血,部分心肌纤维坏死,成年小鼠AAI4.4 mg/kg组损伤程度高于AAI 2.2 mg/kg组,其中肾脏损伤最为严重,肝脏和心脏损伤相对较轻,而AAI对乳鼠的肾脏、肝脏和心脏并无明显损伤。(二)AAI和AAT在乳鼠和成年小鼠体内代谢差异研究。实验给药后2 h迅速达到峰浓度,在峰浓度时,AAI在乳鼠血中的浓度只有成年小鼠的55.9%,随后呈同等趋势下降,在尿中AAI的浓度变化趋势和血中相一致;AAT在乳鼠和成年小鼠血中达峰时的浓度无明显差异,但在尿中差异显著,达峰时乳鼠尿中AAT的浓度只有成年小鼠的35.1%。(三)评价活血化瘀方对AAI致成年小鼠肝、肾毒性的治疗作用研究。实验动物整体情况:成年小鼠AAI 4.4 mg/kg组第6天出现死亡,最终死亡率为100%,而活血化瘀方7.5 g/kg、15 g/kg组分别从第8天和第10天出现死亡,最终存活率分别为30%和50%,实验期间活血化瘀方治疗组小鼠体重逐渐增长,生命力更加旺盛,毛发更加光滑,行动力也更强。血清学检测结果显示,与对照组相比,模型组成年小鼠肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平显著上升(p<0.05),而活血化瘀方15 g/kg组治疗后上述指标均显著下降(p<0.05);HE染色结果显示,与对照组相比,模型组小鼠肾小管坏死严重,淋巴细胞明显浸润;肝小叶多数肝细胞核溶解和核破碎,少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润,与模型组相比,活血化瘀方15 g/kg组肾小管损伤程度明显减轻,淋巴细胞浸润减少;而肝小叶部分细胞核溶解和核破碎,炎性细胞浸润减少。结论综上所述,本课题通过评价AAI在乳鼠和成年小鼠中的毒性和体内代谢差异,发现在等体积比剂量下和同一时间内,AAI在成年小鼠中入血量显著高于乳鼠,解释了马兜铃酸I致乳鼠和成年小鼠死亡差异的原因,而乳鼠对AAI的代谢能力显著高于成年小鼠,但对AAT的排泄速度显著低于成年小鼠,表明AAT容易在乳鼠体内蓄积,并研究发现活血化瘀方可通过改善肝、肾功能来减轻AAI在成年小鼠体内的毒性,为临床误服马兜铃酸相关制剂的患者提供了新的治疗视角及方案。