【背景】众所周知，XIAP通过抑制caspase活性参与调节细胞凋亡[1]。在多种恶性肿瘤组织中，XIAP表达上调，包括前列腺癌[2]，急性和慢性白血病[3,4]，及其他恶性肿瘤[5-7]。XIAP的表达程度与肿瘤的侵袭和转移能力有关[8,9]。已发现XIAP与一些肿瘤的发生如吸烟诱导的肺癌等的相关性[10]。除了参与细胞凋亡调节外，它也有其他非细胞凋亡的生物学功能，如参与信号转导，参与铜代谢，参与泛素化等[11]。在凋亡抑制蛋白（IAP）家族成员中，XIAP是最有潜力的肿瘤治疗靶标。研究证实，使用化学抑制剂或小干涉RNA（siRNA）抑制XIAP表达能够抑制肿瘤细胞增殖[12,13]，但已有研究并没有阐明XIAP是直接抑制肿瘤细胞增殖，或是通过其他间接效应抑制肿瘤细胞增殖。XIAP蛋白由位于N端的三个BIR（Baculovirus IAP Repeat）结构域和C端的RING（Really Interesting New Gene）结构域构成[14]。XIAP通过与caspase3/7/9结合发挥调节细胞凋亡的功能[14]。XIAP的RING结构域有E3泛素连接酶活性，通过标记靶蛋白与泛素分子连接，促进蛋白的泛素化降解。XIAP RING结构域通过调节不同靶蛋白的降解途径发挥不同的生物学功能，包括细胞死亡[15]、炎症[16]和迁移[17]。我们最近的研究证实XIAP敲除或低表达能够降低HCT116细胞迁移及侵袭，而恢复XIAP表达能够逆转这种改变[18]，首次证实XIAP具有调节恶性肿瘤细胞迁移和侵袭的能力。我们进一步的研究证实XIAP能够与RhoGDIα结合，抑制RhoGDIα在第138位组氨酸的SUMO化影响蛋白的稳定，进而影响小Rho GTP酶活性，肿瘤细胞β-actin多聚化、细胞骨架重排和细胞迁移[18,19]。因此，发现和鉴定XIAP非细胞凋亡的生物学功能具有十分重要的生物学意义。【目的】本课题拟在实验室前期研究的基础上，旨在对XIAP调节肿瘤细胞增殖的分子机制进行研究。【方法】（1）利用脂质体转染法将HA-XIAP、HA-XIAP RING、HA-XIAP BIR、HA-XIAP H467A及pcDNA3.0空质粒转染入HCT116XIAP^-/-细胞，经过抗生素筛选构建稳定转染细胞株；（2）利用软琼脂克隆形成实验检测不同稳定转染细胞株的克隆形成能力；（3）利用ATP酶活性检测实验检测不同稳定转染细胞株的细胞增殖速度；（4）利用PI染色的流式细胞检测测定细胞周期分布；（5）利用western blot实验检测细胞周期调节蛋白表达；（6）利用RT-PCR实验检测NFAT基因的转录；（7）通过NFAT报告基因转染后检测荧光素酶活性；（8）通过脂质体转染Akt激酶的显负性突变体DN-Akt质粒并建立稳定转染细胞株，观察抑制Akt活性对细胞克隆形成能力的影响；（9）通过脂质体转染cyclin E特异的shRNA质粒减低cyclin E表达；（10）通过软琼脂克隆形成实验检测抑制cyclin E表达对细胞克隆形成能力的影响；（11）利用向细胞内转染E2F1突变的cyclin E启动子报告基因质粒并检测荧光素酶活性检测E2F1转录因子在XIAP调控cyclin E转录中的作用；（12）利用免疫共沉淀实验检测XIAP BIR结构域与E2F1蛋白的结合能力；（13）通过分离提取细胞核蛋白/胞浆蛋白检测转录因子转位；（14）通过脂质体转染c-Jun显负性突变体TAM67检测其对XIAP介导的cyclin D1转录的影响；（15）利用免疫共沉淀检测c-Jun和PP2A蛋白在细胞内的结合。【结果】1．XIAP不同结构域和E3连接酶活性分别调节肿瘤细胞增殖（1）软琼脂克隆形成实验结果显示，XIAP^-/-（vector）细胞形成克隆的数量较WT（vector）细胞明显减少；向XIAP^-/-细胞中转染HA-XIAP后，克隆形成数量明显增加。但是向XIAP^-/-细胞中转染HA-△BIR和HA-XIAP H467A表达质粒后，与XIAP^-/-（vector）细胞相比克隆形成数量没有明显改变，XIAP^-/-（HA-△RING）细胞克隆形成数量和大小明显增加。（2）ATP酶活性检测细胞增殖能力，结果与软琼脂内克隆形成实验趋势一致。这一结果说明，XIAP调节肿瘤细胞克隆形成能力是通过影响细胞增殖速率发挥作用的。2．XIAP的BIR结构域影响NFAT1转录因子的蛋白稳定性及其生物学功能（1）Western Blot显示在XIAP^-/-（vector）、XIAP^-/-（HA-△BIR）细胞内Akt激酶第308和473位的磷酸化水平高于其他细胞。（2）转染Akt激酶的显性负性突变质粒（Dominant negative mutant Akt, DN-Akt）抑制Akt磷酸化发现XIAP^-/-（HA-△BIR）细胞在软琼脂内的克隆形成恢复正常。（3）Western blot结果显示在XIAP^-/-（vector）和XIAP^-/-（HA-BIR）细胞中NFAT1蛋白表达低于正常，荧光素酶报告基因检测显示NFAT依赖的转录活性低于XIAP^-/-（HA-XIAP）细胞。（4）在XIAP^-/-（vector）和XIAP^-/-（HA-BIR）细胞中NFAT1蛋白的降解速度比WT细胞中快。（5）XIAP BIR结构域缺乏时MDM2的磷酸化增加，XIAP BIR结构域调节MDM2的磷酸化与Akt磷酸化增高有关。以上结果显示，XIAP介导的细胞凋亡信号通路和Akt介导的细胞生存信号通路之间存在相互影响。3．XIAP RING结构域缺失影响cyclin E基因转录及其生物学功能（1）流式细胞检测显示XIAP RING结构域缺失影响肿瘤细胞G1/S期过渡，G0/G1期比例明显减少。（2）Western blot结果显示，XIAP RING结构域缺失的细胞内cyclin E表达增高。（3）RT-PCR和启动子报告基因分析显示cyclin E表达发生在转录水平。（4）使用cyclin E特异的shRNA转染XIAP^-/-（HA-△RING）细胞，抑制了细胞异常增殖的能力。（5）启动子报告基因分析显示，XIAP RING结构域缺失影响cyclin E表达与E2F1转录因子转录活性增强有关。（6）免疫共沉淀显示，XIAP通过BIR结构域与E2F1结合。（7）蛋白亚定位分析显示，XIAP的RING结构域影响XIAP蛋白的细胞内亚定位。以上结果显示，XIAP能够通过BIR结构域与E2F1结合增强其对下游基因的转录活性，当RING结构域缺失的情况下，XIAP在核内异常表达，影响了肿瘤细胞的增殖能力。4．XIAP通过其RING结构域的E3连接酶活性调节cyclin D1基因转录及其生物学功能（1）XIAP^-/-（vector）细胞处于G0/G1期的比例较WT（vector）细胞明显增加，达到84.58%；转染了HA-XIAP的XIAP^-/-细胞处于G0/G1期的比例为69.31%，与WT（vector）细胞（71.51%）相比无明显区别；转染了HA-XIAP H467A的XIAP^-/-细胞处于G0/G1期的比例为78.94%，与XIAP^-/-（vector）细胞接近。（2）Western blot结果显示，XIAP E3连接酶活性能够影响cyclin D1蛋白表达，对其他细胞周期调节蛋白的表达没有影响。（3）RT-PCR和启动子基因报告检测证实XIAP的E3连接酶活性影响cyclin D1转录。转录因子转位分析结果显示，c-Jun磷酸化和AP-1转录因子可能参与了XIAP E3连接酶活性调节的cyclin D1转录。（4）荧光素酶报告基因分析结果显示，XIAP的E3连接酶活性可以影响AP-1转录活性。（5）c-Jun的显性负性突变体TAM67能够改变XIAP E3连接酶活性调节的cyclin D1表达。（6）免疫共沉淀证实PP2A能够与c-Jun在细胞内结合。（7）抑制PP2A活性能够使c-Jun磷酸化和cyclin D1表达增高。以上结果提示，XIAP的E3连接酶活性通过PP2A/c-Jun/cyclin D1通路影响肿瘤细胞G1/S期过渡和细胞增殖。以上结果提示， XIAP的E3连接酶活性通过PP2A/c-Jun/cyclin D1通路影响肿瘤细胞G1/S期过渡和细胞增殖。【结论】XIAP蛋白除了调节细胞凋亡，还可以调节细胞增殖，而且其分子结构中的RING结构域、BIR结构域及E3连接酶活性在调节肿瘤细胞生长过程中发挥了不同的作用。XIAP的E3连接酶活性影响肿瘤细胞增殖能力与调节cyclin D1表达有关；XIAP的E3连接酶活性能够抑制PP2A磷酸化，进而影响PP2A对c-Jun磷酸化的调节，从而调节cyclin D1的转录。XIAP的RING结构域缺引起肿瘤细胞中cyclin E高表达，其中BIR结构域能够与E2F1结合促进其转录活性，进而影响cyclin E转录和肿瘤细胞增殖。XIAP的BIR结构域缺失引起肿瘤细胞中Akt磷酸化活性增强，进而影响MDM2磷酸化，NFAT1蛋白稳定性和肿瘤细胞增殖能力。以上结果提示，E3连接酶活性是肿瘤治疗的潜在靶标；以XIAP为靶标的肿瘤治疗需要考虑不同结构域的不同生物学功能；XIAP和Akt介导的细胞增殖调节通路之间存在复杂的调节联系，需要进一步研究其精确的分子调控机制。