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本论文主要研究大肠杆菌利用甘油生产丙酮醇和氢气。研究内容分为两部分:一是对大肠杆菌Lin43进行代谢途径改造,提高胞内辅酶水平,从而提高丙酮醇产量;二是利用大肠杆菌HW2厌氧条件下快速代谢甘油的特性构建氢气高产株。两部分内容都是通过对大肠杆菌进行代谢途径改造,提高菌株利用甘油生产目标产物的能力。(1)大肠杆菌Lin43利用甘油产丙酮醇Lin43菌株由于glpK和glpR基因突变,能快速代谢甘油积累丙酮醛,丙酮醛在酶YqhD的催化下转化为目标产物丙酮醇。利用质粒pCA24N过表达yqhD基因,并敲除竞争性旁路控制基因gloA后,在含10 g/L甘油的M9培养基中,胞外丙酮醇产量从0.04 g/L提高到1.6 g/L。之后通过代谢途径改造,添加葡萄糖,提高胞内辅酶水平从而促进酶YqhD催化。首先利用质粒pHN1009沉默gapA基因,并在培养基中添加1 g/L葡萄糖,使PP途径形成环路,胞内NADPH较未沉默前提高了69.3%,丙酮醇产量提高了31.8%,说明gapA基因的沉默对胞内NADPH含量有提高作用,从而使丙酮醇产量也有所提高。然后利用质粒pBbB5k分别过表达转氢途径中的nadK、pntAB以及同时过表达nadK和pntAB基因,胞内NADPH含量相对于Lin43ΔgloA pCA24N-yqhD分别提高了123.7%、94.0%和136.8%,丙酮醇产量分别提高了61.0%和53.3%和63.7%。因此NADPH含量的提高会导致丙酮醇产量的提高。同时沉默gapA基因和过表达nadK、pntAB基因后胞内NADPH含量提高了160.5%,丙酮醇产量提高了73.1%。以Lin43菌株为对照,对Lin43ΔgloA pCA24N-yqhD pHN1009-gapA pBbB5K-nadK-pntAB进行RT-PCR测定相关基因表达量的变化,结果为gapA基因下调4.8倍、zwf基因上调2.0倍,nadK、pntA、pntB分别上调了2.3、1.8、2.2倍。最后获得的Lin43ΔgloA pCA24N-yqhD pHN1009-gapA pBbB5K-nadK-pntAB菌株,在含20 g/L甘油和2 g/L葡萄糖的M9培养基中,在初始OD为20时,丙酮醇产量为7.9 g/L。(2)大肠杆菌HW2利用甘油产氢气HW2为大肠杆菌BW25113敲除frdC基因后经过适应性进化78代后获得的菌株,能够在厌氧条件下快速代谢甘油,产氢气。利用菌株这个特性,敲除产氢途径中的主要竞争旁路控制基ldhA和mgsA。单独敲除ldhA基因及mgsA分别使菌株产氢量提高至1.5倍和1.4倍,同时敲除ldhA和mgsA基因使氢气产量提高至1.6倍。然后过表达产氢关键基因dhaKL,菌株氢气产量为(571.5±30.3)μmol/mg protein,是对照菌株的1.5倍,DHAK酶活为对照菌株的13倍。最终获得高产菌株HW2△ldhA△mgsA pCA24N-dhaKL的氢气产量为(571.5±30.3)μmol/mg protein,是原始菌株HW2的2.1倍。