【研究背景及目的】脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）致残率高，严重影响患者的生存质量。大多数脊髓损伤是强力撞击造成椎体错位或骨折引起脊髓挤压或挫伤，此为原发性脊髓损伤；然而在脊髓损伤病情的进展中，继发性损伤往往具有更大的破坏力。原发性创伤性脊髓损伤后短时内即可产生大量氧自由基（reactive oxygen species, ROS），是继发性脊髓损伤的关键因素，可导致神经元功能障碍、死亡、凋亡，以及炎症反应的扩大；此外，ROS是激活星形胶质细胞（astrocytes, AGs）的关键诱因之一。AGs活化可导致蛋白聚糖和中间丝如胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidicprotein，GFAP）的过度合成和分泌，形成的胶质疤痕成为物理隔离，是阻碍中枢神经系统损伤后神经轴突再生和修复的关键因素。活化的AGs还可释放大量炎症因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，不但使受损组织内炎症反应扩大，还可以自分泌的形式持续激活自身生成更多的ROS和炎症因子导致神经毒性，形成恶性循环。目前，尚无神经保护疗效确切的抗氧化剂药物可应用于临床。近期研究表明，氢分子是一种安全有效的新型抗氧化剂，可有效清除OH和ONOO等自由基，从而对抗脑、肝、心肌、小肠的等组织缺血再灌注诱发的氧化应激损伤，这种选择性清除自由基的能力使其较大多数已知的抗氧化剂来说具有相对较小的副作用。此外，我们在前期研究中发现，腹腔注射饱和氢气生理盐水可以改善脊髓损伤后大鼠后肢运动功能的恢复，然而这种脊髓保护作用的可能机制尚不明确。综上所述，鉴于氧化损伤与继发性脊髓损伤进展的密切关联，本研究通过在体实验（大鼠脊髓损伤模型）和离体实验（诱导氧化损伤的细胞模型），采用行为学、免疫组织化学、酶联反应吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和统计学分析等多种方法，欲证明氢分子可抑制继发性脊髓损伤相关的星形胶质细胞过度活化增生，降低炎症因子的释放，减少神经元凋亡并促进轴突修复再生，从而促进功能恢复，起到神经保护作用。相关研究将为脊髓损伤围手术期及早实施干预，进行脊髓保护以提高功能恢复，提供新的理论依据和治疗策略。【研究方法】1.建立大鼠Allen脊髓打击模型，研究富氢生理盐水对组织炎症、星形胶质细胞增殖活化、以及大鼠后肢运动功能的影响术前以BBB评分测定大鼠后肢运动功能，将大鼠随机分为三组：（1）Sham+生理盐水（normal saline, NS）对照组（n=24）；（2）Allen+NS组（n=24）；（3）Allen+富氢生理盐水（hydrogen-rich saline, HS）组（n=24）。术毕即刻及术后每12小时，以8ml/kg的剂量腹腔注射HS或NS。术后第3天以ELISA检测局部受损脊髓组织内三种炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的含量，以Western-blot检测STAT3、p-STAT3和GFAP表达水平的变化；术后第7、14天通过免疫组织化学方法检测局部受损脊髓组织星形胶质细胞活化水平的变化；分别于术后第1、7、14天进行BBB评分。2.纯化培养原代星形胶质细胞，研究富氢培养基对诱导氧化损伤后星形胶质细胞增殖活化的影响纯化培养大鼠皮质星形胶质细胞，以Feton反应（H2O2100μM+氯化亚铁（ferrous chloride, FeCl2）15μM）诱导氧化损伤，分为四组：（1）常规培养基（normalmedium, NM）对照组；（2）富氢培养基（hydrogen-rich medium, HM）组；（3）NM+H2O2组；（4）HM+H2O2组。12小时后，以化学发光法比较各组细胞内ROS和OH生成水平，以及用免疫细胞化学和ELISA法分别检测星形胶质细胞GFAP、5-BrdU的表达以及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放水平。3.纯化培养脊髓神经元，研究富氢培养基对诱导氧化损伤后脊髓神经元凋亡及生长的影响纯化培养大鼠脊髓神经元，以Feton反应诱导氧化损伤，分为四组：（1）NM对照组；（2）HM组；（3）NM+H2O2组；（4）HM+H2O2组。12小时后，以化学发光法检测神经元胞内ROS和OH的生成水平，以TUNEL染色及caspase-3免疫细胞化学法比较神经元凋亡情况，以及Western-blot检测GSK-3β和p-GSK-3β的表达水平。4.统计学处理数据使用SPSS17.0统计软件进行分析，结果以X±SD表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），行为学数据采用重复测量方差分析（one-wayANOVA），p <0.05时认为差异具有统计学意义。【研究结果】1、腹腔注射富氢生理盐水可降低脊髓损伤急性期组织内炎症因子的释放、抑制反应性星形胶质细胞活化增生，并显著改善大鼠后肢运动功能的恢复脊髓损伤术后第3天，HS组局部损伤的脊髓组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量较NS组显著降低（Allen+HS组vs. Allen+NS组：431.62±50.71vs.653.49±69.89，p <0.01；101.40±11.41vs.134.54±21.83，p <0.01；718.29±127.40vs.1085.892±.319.73，p <0.05），且STAT3、p-STAT3和GFAP的表达水平明显下降（0.40±0.03vs.0.66±0.04，p <0.01；1.09±0.09vs.1.26±0.05，p <0.05；1.03±0.05vs.1.45±0.09，p <0.01）。此外，腹腔注射HS可使术后第7、14天损伤局部脊髓中星形胶质细胞GFAP的荧光强度显著下降（1952.21±88.67vs.2386.92±273.73，p <0.01；2684.07±286.01vs.7821.48±122.24，p <0.01），以及明显提高脊髓损伤后第7、14天大鼠BBB评分（7.33±0.52vs.5.33±0.82，p <0.01；10.83±0.75vs.7.67±0.52，p <0.01），并具有治疗作用（p <0.01）。2、富氢培养基可使过氧化氢诱导氧化损伤的星形胶质细胞内氧自由基的生成减少，抑制星形胶质细胞活化增生HM明显降低H2O2氧化损伤12小时后星形胶质细胞内ROS和OH的生成（HM+H2O2组vs. NM+H2O2组：456.61±132.69vs.1827.84±169.07，p <0.01；771.04±47.57vs.1257.27±210.93，p <0.01），并且下调星形胶质细胞反应性增殖DNA的合成和GFAP的表达（49.67±2.52vs.91.67±2.52，p <0.01；2619.56±503.58vs.6275.07±233.05，p <0.01），以及抑制星形胶质细胞功能性活化所致三种炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放（723.99±124.58vs.917.15±74.42，p <0.01；2081.48±38.22vs.2605.61±47.32，p <0.01；2449.78±321.75vs.3356.18±195.41，p <0.01）。3、富氢培养基可使过氧化氢诱导氧化损伤的神经元胞内氧自由基的生成减少，并降低神经元的凋亡水平HM明显降低H2O2氧化损伤12小时后神经元胞内ROS和OH的生成（HM+H2O2组vs. NM+H2O2组：569.40±68.00vs.1834.00±181.50，p <0.01；759.80±65.93vs.1855.00±216.20，p <0.01），并且使TUNEL阳性的细胞比及caspase-3荧光强度均下降（31.67±3.51%vs.60.67±4.93%，p <0.01；480.60±72.98vs.1425.00±73.92，p <0.01）4、富氢培养基可促进过氧化氢诱导氧化损伤的神经元内糖原合成激酶-3β的磷酸化H2O2诱导氧化损伤后，神经元GSK-3β的总表达量在组间差异无显著性（p>0.05），但其磷酸化失活状态即p-GSK-3β的比例显著降低（NM+H2O2组0.35±0.04vs. NM组0.78±0.06，p <0.01）；而HM可促进GSK-3β磷酸化，使p-GSK-3β的比例升高（HM+H2O2组0.54±0.08vs.与NM+H2O2组0.35±0.04，p <0.01）。【研究结论】氢分子可抑制大鼠挫伤性脊髓损伤后脊髓组织中星形胶质细胞的反应性活化增生和胶质疤痕的形成，并减轻组织炎症。此外，氢分子能够降低H2O2氧化损伤后星形胶质细胞和神经元胞内ROS尤其是OH的生成，抑制星形胶质细胞的过度增殖活化及其炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放，以及减少神经元凋亡，并促进其GSK-3β的磷酸化，从而利于神经元生长，具有神经保护效应。而抗胶质活化增生是氢分子具有神经保护作用的另一种潜在机制，这为氢分子应用于临床促进脊髓损伤后轴突再生和修复提供了理论依据。