变异链球菌基因诱导表达系统及其应用

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基因表达系统在研究代谢途径、信号通路、基因表达调控等方面都起到重要作用。其被广泛的应用于生物、食品、工业以及医学领域,以原核生物细胞及真核生物细胞作为表达系统,进行目的基因序列的表达以生产蛋白疫苗、核酸疫苗和生物酶制剂等是近年来发酵工业的新型领域。诱导基因表达系统是一种特异性、高效率及剂量依赖性的系统,该系统已经成功的应用于酶、多肽、中间代谢物等表达产物的生产,对食品、医药、保健业和工业等领域大发展起到极大的推动作用。通过利用强启动子将克隆基因整合到染色体上,构建高效的诱导性表达载体,通过不同的诱导方法,实现外源蛋白的高效表达。目前,对于变异链球菌的诱导系统构建已有相关研究,但将该系统与转座系统相结合用于探究一些相关基因的功能等方面尚且不足。本论文以变异链球菌(Streptococcus mutans)UA159为研究对象,旨在构建一个适用于该菌的一个能够有效控制基因表达以及能与转座系统相结合的诱导型表达系统。主要研究结果如下:(1)在变异链球菌UA159中将转座元件与已有的两个木糖诱导系统S2和S1结合构建了两个转座载体 pLH475(pLH1 45::gyrAp::xylR::xy/Ap::xy/Ao::marc9::ermAM)和pLH630(pLH145::gyrAp::xy/R::1dhp::xy/A。::marc9::ermAM),通过木糖诱导实验后发现这两个系统都无法达到无诱导物情况下低表达水平,有诱导物时高水平表达。前者在添加木糖诱导后无发生转座,后者在不加木糖诱导时也能有大量转座子出现,且转座位点单一。(2)新的诱导表达系统的构建S3。通过对木糖诱导阻遏物基因xylR的RBS区域进行改造后构建出一个新的诱导系统,再用该系统构建一个荧光素报告质粒pLH632(pLH421::gyrAp::xy/R::ldhp::xylAo::luc),通过荧光素酶活性检测试验结果发现,该系统能够在无诱导物时低水平表达,比S1表达水平低出4倍,在加入木糖诱导后,新的诱导系统表达水平也较高比S2的表达量高出约2.8倍,成功构建出一个低基础表达水平、高诱导表达水平的诱导表达系统。(3)将新的诱导表达系统S3与转座元件结合构建转座载体pLH631(pLH145::gyrAp::xy/R,::/dhp::xylAo::marc9::ermAM)转化入变异链球菌 UA159 中,进行木糖诱导实验后结果发现,在不加入木糖诱导时转座有少量或者无转座子出现,在加入0.4%木糖时转座子数目达到最大,且转座率最大达3%。对转座子进行一些列处理后测序结果发现,转座子插入位点具有多样性。(4)运用转座系统筛选抗性突变株,将转座载体pLH631转化入变异链球菌UA159中进行木糖诱导后发生转座,将发生转座的突变株涂布在含醋酸氯已定抗性的平板上筛选出抗醋酸氯已定的突变株,筛选出的突变株插入基因是SMU1349,且经过试验证明插入突变能够稳定遗传。
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