论文部分内容阅读
卵泡刺激素（Follicle stimulate hormon,FSH）是由脑垂体分泌的一种糖蛋白激素,在女性,FSH对卵泡发育的启动及随后卵泡的成熟及卵泡数目均至关重要,可促进性腺功能障碍的女性卵巢卵泡的生长,并可用于辅助生殖技术中促使多个卵泡发育;对于男性可诱导精子的产生。基于天然FSH的生理作用及局限性,重组的rFSH也被广泛应用于诱导不排卵患者排卵及在辅助生殖技术中诱导患者超数排卵。首先rFSH的免疫原性很低,到目前为止尚未报道发现中和抗体;其次rFSH体内半衰期较天然结构的FSH显著增长;另外rFSH克服了天然FSH来源有限、生物活性低的问题。常用的rFSH是将构建的表达载体转入中国仓鼠卵巢细胞（CHO）稳定表达,收获含有目的蛋白的上清液进行生物制品的制备。为了获得稳定高产量的重组蛋白,CHO细胞大规模培养的过程中基本采用无血清培养,无血清培养避免了血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险、批次之间差异。因此长效重组FSH的开发是本领域的研究热点。本文将牛的FSHα和β亚基通过含有两个N-连接糖基化位点的多肽序列融合为单链蛋白,使用CHO-K1细胞作为工程细胞,经过无血清驯化培养得到种子细胞。在生物反应器中利用CHO细胞易于结团的特性,采用流加培养的方式,通过控制CHO结团大小进行发酵;并对培养过程中葡萄糖和谷氨酰胺及代谢产物乳酸的动态变化进行检测和分析,结果细胞密度可达到2.0×106cells/mL,目的蛋白产量2.8 mg/L。通过超滤浓缩、盐析、阴离子交换（DEAE）层析纯化蛋白,SDS-PAGE与Western Blotting鉴定分析,初步探索了适用于生产rFSH类似物的发酵及纯化工艺。为了鉴定目的蛋白经过CHO细胞表达是否正确的翻译后修饰,哪些位点发生了N-糖基化,为其延长体内半衰期提供实验依据。本课题采用多种凝集素富集的方法检测低丰度N-糖基化蛋白,首先用蛋白酶酶解蛋白质,凝集素富集被N-糖基化修饰的肽段,N-糖酰胺酶（PNGase）在H218O中切除连接在天冬酰胺残基（Asn）上的糖链,使Asn分子量增加2.9890 Da。通过液相色谱质谱（LC-MS）鉴定脱糖后的多肽,最后用Mascot软件对质谱数据与数据库进行比对,从而确定该目的蛋白质的α亚基N52、N78和β亚基N7发生糖基化修饰。本论文利用双向电泳技术和MALDI-TOF-MS质谱技术选取2-DE图上可能的蛋白点进行质谱鉴定最终确定目的蛋白的等电点在4.0-5.2左右,为rFSH蛋白的大规模发酵及下游纯化工作提供蛋白理化性质数据。本课题开发的rFSH类似物作为一种新药,临床前的毒理学研究是必需的。本文研究了rFSH类似物的急性毒性及遗传毒性。急性毒性试验给药后,连续观察7天中小鼠的生理状态、体重、脏器系数指标,结果表明在实验剂量0.2mg/kg长效卵泡刺激素类似物无急性毒性;小鼠骨髓细胞微核试验以卵泡刺激素类似物最大耐受剂量为高剂量,高中低剂量分别为0.2 mg/kg、0.1 mg/kg、0.05mg/kg,结果显示各剂量组小鼠骨髓细胞微核率与阴性对照组比较无统计学差异,可初步判断长效卵泡刺激素类似物在本实验剂量范围内对小鼠骨髓细胞微核无遗传毒性。