论文部分内容阅读
大豆(Glycine max(L.)Merr.)是典型的短日植物,在光周期现象研究中被作为重要模式材料。近十年来,大豆开花期相关的关键基因先后被定位和克隆,开花调控分子机制研究逐步深入。在已发现的调控大豆开花期的E系列基因中,豆科植物所特有的E1基因对开花期影响最大,并且发现在大豆中存在两个E1同源基因E1La和E1Lb,这两个E1同源基因对大豆的生育进程也有抑制作用。本研究应用根癌农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系,采用RNAi技术和CRISPR/Cas9系统对E1基因进行功能分析,以期从多角度验证其在大豆生育进程中所起的作用。主要研究成果如下:1.参照Williams 82基因组信息设计合适的引物,克隆晚熟品种自贡冬豆和中熟品种Jack的E1和E1La/b,将所得序列在NCBI上进行比对,得知3个基因在自贡冬豆中的基因型分别为E1、E1La和E1Lb,在Jack中的基因型分别为e1-as、E1La和E1Lb。该实验结果为后续实验中引物的设计和转化受体的选择提供了理论依据。2.利用GATEWAY技术和植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒构建了RNA干扰载体pB7GWIWG2(II)-E1和基因编辑载体CRISPR/Cas9-E1,两个载体均带有筛选基因bar。借助农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化技术,将两个载体分别转入受体基因型自贡冬豆中,通过除草剂涂抹、PCR和试纸条检测三种方法分别鉴定出38和46株阳性转化植株。3.E1-RNAi T1植株在北京夏播自然条件下可提前开花,比野生型在短日条件下开花更早。鉴于E1基因干扰植株的早熟表型,在8月中旬北京自然条件下对其进行加代扩繁,T2转基因植株的开花期和成熟期均显著早于野生型植株。在E1基因干扰后代植株中,E1、E1La和E1Lb基因的表达量均显著降低,受E1基因上调表达的开花抑制因子GmFT4基因表达量也呈现下降趋势,而开花促进因子GmFT2a/5a基因的表达量升高。4.经测序检测,4株E1-CRISPR/Cas9 T0植株在E1靶位点处发生了编辑,有1株在T1代发生编辑并产生了1株纯合突变体植株和6株杂合突变体植株。E1基因纯合突变体植株在北京夏播后期短日处理的条件下开花时间稍早于野生型,E1基因杂合突变体与野生型无明显差异。