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研究背景与目的根据全球流行病学的调查,脑卒中(Cerebral Stroke)是导致人类死亡的第二大病因,其中缺血性脑卒中是脑血管病中最常见的一种类型,由于其高致残率与高死亡率等原因,脑卒中仍然对人类生命健康构成重大的威胁。现今缺血性脑卒中的治疗手段十分有限,至今仍缺乏有效的临床治疗药物。深入研究缺血性脑卒中的发病机制以及寻找其潜在的治疗靶点是现在研究的热点。Pannexin1广泛分布于哺乳动物的中枢神经系统中,主要位于细胞膜上,形成膜通道结构。已有研究发现基于Pannexin1的脑梗死治疗策略在部分动物实验中得到验证,但对于Pannexin1蛋白在脑梗死中的表达情况尚未有较深入研究。因此本课题通过小鼠脑缺血模型探讨Pannexin1表达的改变,希望为后续Pannexin1在脑梗死的作用与机制的研究提供新的理论依据。最近研究发现,表观遗传学机制组蛋白去乙酰化等在缺血性脑梗死的病理机制中也起到重要的作用。在动物脑梗死模型上多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACs Inhibitors)也被证实具有神经保护作用,HDACs家族具有多个亚型,部分亚型的作用与机制已被探讨,其中组蛋白去乙酰化酶9(HDAC9)在脑梗死中的作用尚未深入研究。因此,本课题通过观察HDAC9在脑梗死后表达的情况,探索其与脑梗死发生的关系,从而进一步了解HDAC9在缺血性脑卒中的相关机制。第一部分小鼠脑梗死后脑组织Pannexin1的表达改变及其意义目的:检测线栓法大脑中动脉阻塞(MCAO)后小鼠不同部位脑组织Pannexin1在卒中后不同时间点的表达情况,探讨Pannexin1与缺血性脑卒中的关系。方法:健康雄性C57BL/6小鼠随机分为两组:假手术组与模型组,模型组按照Koizumi’ s线栓法进行小鼠脑梗死模型的构建,假手术组只进行颈部正中纵行剖开后缝合。模型组根据术后不同时间(4h,8h,12h,1d,3d,7d and 14d)提取健侧与患侧脑组织。采用免疫荧光染色观察Pannexin1脑组织内分布位置,以及脑梗死后Pannexin1分别与MAP2和GFAP的关系,采用Western免疫印迹法与实时荧光定量PCR法检测各组不同部位(梗死侧/对侧皮层//假手术组皮层)Pannexin1的表达变化。结果:1.免疫荧光染色:梗死灶周围脑组织Pannexin1的荧光强度较其他部位明显增强。2.免疫荧光双标染色:Pannexin1与MAP2存在共定位,与GFAP不存在共定位表达。3.蛋白与mRNA表达检测:(1)小鼠梗死侧脑组织Pannexin1的表达比健侧大脑及对照组高,并具有统计学意义(P<0.05),mRNA与蛋白表达的情况相似。(2)脑梗死后4小时,Pannexin1的表达已出现上调,到梗死后3天达到高峰,而后逐步下降,到14天Pannexin1的表达仍高于对照组。(3)进一步检测Pannexin蛋白家族另一亚型Pannexin2表达情况:脑梗死后Pannexin2蛋白并没有发生上调或下调。结论:1.脑梗死后Pannexin1表达的上调及随时间表达改变的情况,进一步说明Pannexin1与缺血性卒中密切相关。2.小鼠脑梗死后Pannexin1主要在神经元内表达,而非星形胶质细胞上。3.Pannexin2蛋白可能不与Pannexin1协同参与脑梗死的病理过程。第二部分小鼠脑梗死后脑组织HDAC9的表达改变及其意义目的:检测线栓法大脑中动脉阻塞(MCAO)后小鼠不同部位脑组织HDCA9的表达及胞内分布变化,探讨HDAC9与缺血性脑卒中的关系。方法:健康雄性C57BL/6小鼠随机分为两组:假手术组与模型组,模型组按照Koizumi’ s线栓法进行小鼠脑梗死模型的构建,假手术组只进行颈部正中纵行剖开后缝合。采用免疫荧光染色观察HDAC9脑组织内分布位置与胞内分布变化,采用Western免疫印迹法与实时荧光定量PCR法检测各组不同部位(梗死侧/对侧皮层/MCAO组小脑/假手术组皮层/假手术组小脑)HDAC9的表达变化。结果:1.免疫荧光染色:(1)脑梗死后,梗死灶周围脑组织HDAC9的荧光强度较其他部位明显增强。(2)高倍镜下与假手术组对比,梗死灶周围HDAC9胞浆内表达增多,核内表达减少。2.蛋白与mRNA表达检测:与各组对比,梗死侧脑组织HDAC9表达显著升高,具有统计学差异(均P<0.05),蛋白与mRNA表达情况相一致。结论:HDAC9表达的上调以及细胞内表达的改变与缺血性卒中密切相关,可能参与其病理生理过程。