脂肪酶是具有催化多样性的酶,可以用于多种生物催化反应,本研究探讨了脂肪酶在催化过氧化反应中的应用及其催化特性。过氧酸是有机合成中重要的氧化剂,能够将氧原子引入烯烃、环酮和胺类等化合物中。脂肪酶催化羧酸和过氧化氢发生的过氧化反应是原位合成过氧酸的主要途径,进而用于烯烃的环氧化反应和酮类的Baeyer-Villiger(BV)氧化反应等。然而,在实际工业化生产中,由于脂肪酶固有的催化特性,使得对其利用仍然存在一定的局限,如在BV氧化反应过程中,脂肪酶在催化酮合成酯的同时,也能催化酯水解生成酸。针对这一科学问题,本论文选取来源于Malassezia globosa的偏甘油酯脂肪酶(SMG1)和目前工业应用最广泛的来源于Candida antarctica的脂肪酶B(CalB)为研究对象,研究了脂肪酶的催化反应机理,并通过分子生物学技术对选取的酶进行改造,使其具有理想的催化性能。首先,本研究制备了野生型脂肪酶SMG1和CalB,然后以pGAPZ?A-SMG1和pGAPZ?A-CalB质粒为模板,克隆表达制备了脂肪酶SMG1和CalB的突变体。本研究对所制备的脂肪酶酶学性质进行了测定,评价了脂肪酶SMG1和CalB的水解和酯化活力,进一步证明脂肪酶SMG1是偏甘油酯脂肪酶,不能合成甘油三酯,却可以水解和合成甘油二酯;而脂肪酶CalB可以水解和合成甘油三酯,但其水解活力较弱。通过测定脂肪酶SMG1对卵磷脂和溶血性卵磷脂的水解活性,发现脂肪酶SMG1在底物选择性上偏好于DAG结构类似的底物。其次,研究了SMG1野生型及其Ser171Ala和His281Ala突变体催化不饱和脂肪酸和烯烃的环氧化反应的能力。研究发现野生型和Ser171Ala突变体均可以催化环氧化反应,而His281Ala不能催化环氧化反应。因此His281是SMG1催化环氧化反应的重要氨基酸,而Ser171不是;我们推测His281在环氧化反应中参与了维持过氧化氢的稳定,而且反应过程中没有形成酰酶复合物;此外由于羧基碳和过氧化氢的氧原子之间的距离太大,因此四面体中间体也不可能形成;His281的侧链既可以和过氧化氢,也可以和羧基氧形成氢键,因此His281介导了过氧酸的形成。综上,脂肪酶SMG1催化环氧化反应是由His介导的,且不依赖酰基酶复合物和四面体形成的机制。此外研究表明脂肪酶SMG1催化环氧化反应遵循两步反应过程,脂肪酶先催化羧酸形成过氧羧酸,然后过氧羧酸和烯烃的双键反应形成环氧化物。最后,本文以应用最为广泛的脂肪酶CalB及其Ser105Ala突变体为研究对象,评价了野生型和突变体催化酮类BV氧化反应的效果。结果发现以Ser105Ala突变体为催化剂可以抑制BV氧化反应中水解副反应的发生;此外,以绿色的低共熔溶剂为反应体系,能显著提高催化反应效率,研究表明低共熔溶剂可以增大反应体系的油/水界面面积并降低油/水界面张力(即增加界面的稳定性),这可能是低共熔溶剂中脂肪酶催化反应效率提升的原因。综上,本论文系统的探讨了脂肪酶SMG1的催化特性,及其催化环氧化反应的机制,为其在脂质改造和环氧化反应中的应用提供了理论参考;对脂肪酶CalB Ser105Ala突变体在BV氧化反应中的研究发现,该突变体可以抑制水解副反应,拓展了脂肪酶在BV氧化反应中的应用;最后探究解释了低共熔溶剂提升催化效率的原因。