乳腺癌是迄今为止全球女性最常见的恶性肿瘤,2014年美国估计有232670例新病例确诊为乳腺癌(占女性恶性肿瘤的29%),约有40000人死于乳腺癌(排在肺癌和支气管癌之后),整体死亡率排名第二(死亡率15%),尽管早期诊断与早期治疗能提高乳腺癌患者临床治愈率,延长生存时间,但是乳腺癌的复发转移,尤其是肺转移(确诊为肺转移后,乳腺癌患者的中位生存时间时间不超过2年)仍然是导致乳腺癌患者死亡的最主要原因,是目前临床面临的严峻挑战。因此,我们迫切需要明确乳腺癌肺转移的分子机制,寻找能准确预测乳腺癌肺转移的标志物。CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚着于细胞膜表面的补体调节蛋白(Membrane complement regulatory protein,mCRP)蛋白,它的主要作用是通过抑制具有靶细胞杀伤效应的补体膜攻击复合物(Membrane attack complex,MAC)的形成,最终抑制补体的激活,保护宿主细胞免受补体的攻击。近年来随着对肿瘤免疫认识的不断加深,许多研究已经证实CD59在很多实体肿瘤中呈现高表达,它能帮助肿瘤细胞逃避补体的攻击;研究还发现肿瘤细胞高表达的CD59可能与肿瘤的浸润和转移相关。然而CD59在乳腺癌中的作用机制并不明确,因此深入探讨CD59在乳腺癌细胞增殖、浸润及侵袭、转移中的作用,揭示CD59对于乳腺癌肺转移患者的预后作用,为临床治疗提供潜在的治疗靶点,具有重要的理论和临床价值。第一章CD59在乳腺癌高肺转移潜能细胞中高表达,激活Akt/ERK信号通路本部分工作的主要目的是鉴定CD59在乳腺癌高肺转移潜能细胞MDA-MB-231-HM中的表达与其在亲代细胞MDA-MB-231中的表达差异,并且进一步分析CD59在MDA-MB-231-HM差异表达的可能机制,为下一步继续探讨CD59对乳腺癌细胞增殖、侵袭方面的影响,建立CD59移植瘤动物模型奠定理论基础。首先,我们选择了实验室构建的具有高肺转移能力的MDA-MB-231-HM和其亲代细胞MDA-MB-231,对MDA-MB-231-HM和MDA-MB-231进行蛋白质印迹法检测补体调节蛋白的表达,我们发现:与MDA-MB-231相比,补体调节蛋白中只有CD59在MDA-MB-231-HM中的表达呈现有差异地增高,而补体调节蛋白中的CD46和CD55并没有呈现出表达差异。流式细胞学检测进一步证实了CD59在MDA-MB-231-HM中的表达较其在MDA-MB-231中的表达显著增高(P<0.05),而不是CD46和CD55;然后根据已知文献报导和实验室的前期工作,我们采用蛋白质印迹法检测导致CD59出现高表达的可能机制,有可能影响和调节CD59的细胞信号通路中的上、下游的细胞信号因子。我们首先研究了核转录因子NF-κB的Spl和核磷酸化水平的Spl,结果表明:NF-κB信号通路的Spl在这两个细胞系之间没有显著差异。然而,另一个转录调控因子CREB磷酸化后在MDA-MB-231-HM中的表达较其在MDA-MB-231中的表达显著增高,已经证实:CREB可以通过磷酸化Akt和磷酸化ERK直接或间接地被磷酸化,所以我们进一步检测了Akt和ERK以及它们的磷酸化后的水平,发现磷酸化Akt和磷酸化ERK在MDA-MB-231-HM中的表达较其在MDA-MB-231中的表达显著增高。通过比较高、低(或无)转移潜能细胞系、或者是比较原发灶与转移灶的差别,运用蛋白质组学的研究手段,比较蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异,以发现与病理改变有关的蛋白质和疾病特异性蛋白质,是目前研究肿瘤转移分子机制的主要思路。我们选用高肺转移潜能的细胞系MDA-MB-231-HM和MDA-MB-231,运用蛋白质印迹法和流式细胞术发现在这两组细胞系中,补体调节蛋白中只有CD59在MDA-MB-231-HM中呈现差异性高表达。CD59是补体系统这个大家族的一个成员,它的主要作用是在补体活化的终末阶段,通过阻止具有靶细胞杀伤效应的MAC的形成,从而在补体级联反应的终末期抑制补体的激活,是补体系统的"抑制蛋白"。除此之外,CD59还具有其他的补体非依赖性功能,包括参与T细胞的粘附及活化信号的转导;通过酪氨酸激酶活化中性粒细胞;抑制肿瘤细胞凋亡,参与肿瘤新生血管形成;参与肢体组织的再生;并可作为肿瘤干细胞的生物标记物等。CD59的转录调控机制非常复杂,目前研究认为涉及很多途径,我们的研究显示CD59在MDA-MB-231-HM中高表达,同时伴随着磷酸化Akt和磷酸化ERK的高表达。研究报导Akt和ERK在肿瘤的发生发展中扮演着重要的作用,由此我们推测CD59在MDA-MB-231-HM中的高表达可能与其高肺转移能力有关,而且可能由Akt和ERK信号通路的活化介导。第二章下调MDA-MB-231-HM中CD59的表达能抑制细胞增殖,减少肺转移本部分工作的主要目的是探讨CD59在MDA-MB-231-HM中对细胞增殖及转移的影响,进一步分析CD59在乳腺癌发生发展和侵袭转移中的作用价值。我们采取了如下研究方案:(1)利用特定的小干扰siRNA下调C59的表达,我们设计了2套特异性shRNA,实验组为231-HM-shCD59和231-HM-shCD59’(对照组相应分别为231-HM-Vector和231-HM-Vector’),通过慢病毒包装、细胞转染及抗生素筛选等一系列步骤,构建相对应的稳转shRNA的细胞株,利用蛋白质印迹法验证稳转细胞株中CD59的表达。(2)采用CCK8法检测下调CD59在调节细胞增殖方面的影响,同时建立两组稳转细胞的原位移植瘤动物模型,分别在雌性无胸腺的裸小鼠的左边第四个乳腺脂肪垫植入两组稳转细胞,监测乳腺肿瘤的生长,第5周处死裸鼠,剥离乳腺肿瘤及肺脏,计量肿瘤的大小及重量,HE染色法检测动物的肺脏组织。通过以上实验方案,我们分别得到了以下结果和结论:(1)CD59在MDA-MB-231-HM-Vector中的表达与在MDA-MB-231-HM中的表达没有显著性的差异,然而CD59在MDA-MB-231-HM-shCD59细胞中的表达较其在MDA-MB-231-HM细胞中的表达显著性地降低(P<0.05),有统计学差异。结果显示:插入的空白载体构建的MDA-MB-231-HM-Vector没有影响CD59的表达,插入的 shRNA载体构建的MDA-MB-23 l-HM-shCD59 和MDA-MB-23 l-HM-shCD59’显著下调CD59的表达,表明稳转细胞株构建成功。(2)CCK8实验结果显示:从细胞铺板后第四天开始,231-HM-shCD59的细胞增长比231-HM-Vector明显减慢,下调CD59的表达能显著抑制肿瘤细胞的增殖(P<0.01);(3)原位移植瘤模型中,实验组荷瘤鼠的肿瘤的大小比对照组荷瘤鼠的肿瘤大小显著性减小,相关的肿瘤重量显示一致的结果(P<0.01)。在HE染色切片动物的肺脏组织,我们发现对照组中10只动物有3只荷瘤鼠的肺脏组织中发现了转移灶,而在实验组中无裸鼠出现肿瘤转移,这些数据表明:下调CD59的表达,可以抑制乳腺癌细胞在体外和体内的增殖,并进一步减少体内肺转移的发生。通过特异性shRNA下调CD59的表达,我们意外地发现不论是体外实验还是体内实验,MDA-MB-231-HM细胞的生长明显被抑制。正如我们所期望的,下调MDA-MB-231-HM细胞CD59的表达,在原位移植瘤模型中显著减少肺转移的发生。这个结果充分说明CD59与MDA-MB-231-HM的高肺转移能力有关,证明我们前一步的设想是正确的。补体调节蛋白,尤其是CD59,可以保护肿瘤细胞免受补体的攻击,促进肿瘤细胞得以生存,从而又可以阻碍以抗体介导的肿瘤免疫对肿瘤细胞的作用。此外,有研究报导CD59的高表达不仅可以保护乳腺癌细胞MCF-7免受补体介导的细胞溶解,而且还可以通过抑制BCL-2促进MCF-7细胞的增殖;相反,下调CD59还可以促进Fas和Caspase-3从而诱导细胞凋亡。我们的研究进一步证实了下调CD59的表达可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231-HM的增殖,减少裸鼠体内肺转移的发生。我们的结论是:MDA-MB-231-HM的高肺转移能力与CD59的高表达有关,下调CD59的表达能抑制乳腺癌MDA-MB-231-HM的增殖,降低肺转移的发生。第三章高表达CD59的乳腺癌患者更容易出现肺转移,预后更差本部分研究的主要目的是理论联系临床,探讨CD59的表达与乳腺癌患者临床特征之间的联系以及对患者预后的可能影响,为此,我们采用免疫组织化学方法检测了 120例临床乳腺癌患者的CD59的表达水平,同时收集这些患者的临床特征以及随访结果,卡方检验分析患者临床特征与CD59表达水平的相关性,Cox比例风险模型分析CD59的预后价值。我们在临床收集了 120例经病理证实的乳腺癌患者,其中58例患者随访出现了肺转移,62例患者随访没有出现肺转移。所有患者均采用免疫组织化学方法(IHC)检测CD59的表达水平,同时收集这些患者的临床病理特征,包括:年龄,肿瘤大小,肿瘤组织学分级,淋巴结状态,有无脉管癌栓,雌激素受体状态(ER),孕激素受体状态(PR),表皮生长因子受体-2状态(HER-2)。我们的研究结果表明:CD59的表达只与患者出现转移事件呈现显著性正相关,有统计学意义(P=0.00l)。在这些患者中观察到CD59表达高的患者呈现出更高比例的表现为HER-2缺失的状态;而CD59的表达与患者的年龄、肿瘤大小、肿瘤组织学分级、淋巴结状态、ER、PR、HER-2均无显著性相关。在这120例乳腺癌患者中,随访出现肺转移的患者占48.3%(58/120),我们采用了逻辑回归模型,进行了单变量和多变量分析去预测这些患者是否出现肺转移。单变量分析的结果显示:肺转移的发生与患者的肿瘤大小、肿瘤组织学分级、ER、PR、HER-2均无显著性相关(P>0.05),而与患者的年龄,淋巴结状态,有无脉管癌栓以及CD59的表达呈现显著性相关(P<0.05)。当患者具有以下特征时更加倾向于容易发生肺转移:年龄≤35岁、淋巴结阳性、有脉管癌栓、CD59高表达。多因素生存分析的结果显示:患者的CD59的表达、淋巴结状态、以及是否伴有脉管癌栓是预测患者出现肺转移的独立预后因素(P值分别为0.041、0.032和0.008)。此外,我们应用Kaplan-Meier生存分析法分析CD59的表达与患者生存的关系,结果证明:CD59表达水平与患者无复发生存率呈现负相关性(P<0.01),CD59的表达更高的患者与CD59的表达较低的患者相比,预后差。Madjd和Mikkel等曾经报导:CD59的表达缺失提示乳腺癌患者更差的预后,CD59的表达水平与转移能力呈现负相关,而我们的研究表明CD59的高表达提示乳腺癌的预后差,CD59的表达水平与MDA-MB-231-HM细胞的生长与转移呈现正相关。在由Madjd报导的包含520名乳腺癌患者的临床研究中,并没有把肺转移作为研究的变量参数,然而我们专注于肺转移并由此选择了 120名乳腺癌患者,把患者区分为转移和非转移两组;此外在我们的研究中,CD59高表达的患者中有很大一部分属于激素受体阴性,Her-2阴性的患者,这些差异可能会导致我们得出不同的结论。乳腺癌临床治疗中的复发风险评估中认为患者年龄≤35岁、淋巴结阳性、伴有脉管癌栓是复发的危险因素,我们的结果与之是一致的。Mikkel等的研究显示:CD59是与转移的侵袭性相关,而不是与转移的本身相关;而在我们的研究中,下调CD59的表达能抑制裸鼠肿瘤的生长,减少肺转移的发生,这些可能是由于肿瘤细胞的生长受到抑制的原因引起。事实上已经有研究报道CD59能通过Src的家族成员Lck介导T细胞的信号传导,我们不能排除在乳腺癌细胞MDA-MB-231-HM中,可能通过CD59传输的信号促进细胞增殖和转移。作为一个生物标志物,CD59在乳腺癌中可能扮演着复杂的角色。由此,我们的研究最终证实:CD59的高表达是乳腺癌细胞MDA-MB-231-HM具有高肺转移能力的重要原因,下调CD59的表达能显著抑制乳腺癌MDA-MB-231-HM的增殖,降低肺转移的发生。临床乳腺癌患者中CD59的高表达与肺转移事件的发生呈正相关(P<0.01),与患者无复发生存率呈现负相关性(P<0.01)。