目的：随着蛋白组学研究领域的急剧扩展，糖蛋白糖链结构与功能的研究是当前蛋白质组学发展后的重要延伸领域。在此我们选用可以识别二天线型和高甘露糖型结构的刀豆凝集素Con A通过固相亲和层析的富集糖蛋白，通过双向电泳、质谱技术来建立相对稳定、标准的高通量糖蛋白质组学共性技术平台，建立和分析人健康肝组织刀豆凝集素Con A结合型糖基化蛋白质数据库，为后续工作奠定了基础。方法：从人健康肝组织中提取总蛋白，通过刀豆凝集素(Con A)亲和柱层析分离和浓集Con A结合型蛋白质，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和双向电泳(2-DE)分离，建立人健康肝组织Con A结合型蛋白表达谱，应用基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS／MS)和数据库搜索鉴定该图谱中所有蛋白点。利用NetNGlyc和NetOGlyc软件对鉴定的蛋白进行糖基化位点预测，应用生物信息学对这些蛋白进行QuickGO搜索，依据三个主要的GeneOntology种类，即生物过程、分子功能和细胞内定位对它们分类分析。结果：人健康肝组织中提取的总蛋白通过Con A亲和层析柱分离为两组份，柱不结合组分由非Con A结合型糖基化蛋白构成；柱结合组份由Con A结合型糖基化蛋白组成。两组份与总蛋白进行SDS-PAGE，发现通过亲和层析使得ConA结合的低丰度糖蛋白得到富集，在60KD处有一明显浓集的条带。对它们进行2-DE分离，并结合SYPRO-Ruby荧光染色技术，获得人健康肝组织Con A结合型蛋白表达谱，PDQuest7．0软件探测到蛋白质点301±15个，分析图谱发现较偏酸性端和碱性端，PI 3-5，MW 25-47KD区域处有多个高丰度蛋白，低分子量糖蛋白亦较多；切取130个蛋白点，应用MALDI-TOF-MS／MS进行鉴定，通过数据库搜索及去冗余后，共鉴定85种蛋白。将这些蛋白进行糖基化位点预测，除5个蛋白仅具有O-连接糖基化位点外，其他蛋白均含有潜在N-连接糖基化位点。应用生物信息学对这些蛋白进行分类，发现参与代谢通路及与细胞周期相关的蛋白分别占35％和22％，Con A结合型总糖蛋白以定位在细胞质和细胞核中为最多。结论：(1)凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS／MS分析是相对稳定的高通量糖蛋白质组学共性技术平台，可用于大量样本的疾病蛋白质组学中蛋白质糖基化修饰谱的研究，对发现与疾病发生、发展中相关的异常糖基化蛋白质有重要价值。(2)本研究建立了人健康肝组织Con A结合型蛋白蛋白数据库，共鉴定出85种蛋白质。它们在胞浆、胞核及胞膜上均有不同程度的分布，参于体内代谢和细胞生理过程，发挥催化和结合反应的作用。目的：本部分我们利用已建立的凝集素亲和层析技术平台富集DSA结合型糖蛋白，通过双向电泳和多维色谱两种途径进行分离，利用质谱鉴定获得的糖蛋白数据来建立人健康肝组织及肝癌组织DSA结合型糖基化蛋白质数据库，为正常状态下，机体内糖蛋白的全面阐述提供基本生物学信息，为蛋白质多天线型糖链结构在体内功能研究提供理论依据。方法：通过免疫荧光检测DSA结合型糖蛋白在人正常肝细胞chang’s liver中的表达和定位，从人健康肝组织及肝癌组织中提取总蛋白，通过蔓陀萝凝集素(DSA)亲和柱层析分离和浓集DSA结合型糖基化蛋白质，分别通过双向电泳、糖蛋白染色复合总蛋白染色、基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS／MS)技术及通过二维色谱(2D-LC)、纳升级电喷雾质谱(nESI-MS)技术对于亲和层析所获得的DSA结合型糖蛋白进一步的分离和鉴定，建立人健康肝组织及肝癌组织DSA结合型糖基化蛋白数据库，并对2-DE和2D-LC两种分离方法进行比较。利用NetNGlyc软件对鉴定的蛋白进行糖基化位点预测，应用生物信息学对这些蛋白进行QuickGO搜索并分类分析。结果：免疫荧光发现DSA结合型糖蛋白定位于细胞膜、胞质及胞核内。通过10％N-乙酰葡萄糖胺寡聚体(Chintin)成功的从人健康肝组织及肝癌组织中总蛋白中分离并富集了DSA结合型糖蛋白，层析得率为4％。比较研究发现肝癌组织和正常肝组织呈现不同的SDS-PAGE和DSA凝集素亲和层析图谱，2-DE电泳结合糖蛋白染色获得人健康肝组织DSA结合型糖基化蛋白表达谱，ImageMaster软件探测到蛋白质点60±3个，分析图谱发现DSA结合型糖蛋白较偏酸性端，PI 4-7，MW 35-85 KD区域处有许多高丰度蛋白；切取糖蛋白质点进行鉴定，去冗余共鉴定出43种糖蛋白；通过2D-LC结合ESI-MS鉴定出人健康肝组织93种蛋白，其中有25种与2DE-MALDI-MS鉴定蛋白相同，且鉴定的分子量范围较后者为广，但仍以偏酸性端的蛋白为多。此外ESI—MS鉴定出肝癌组织DSA结合型糖蛋白98种，与相同条件下鉴定的人健康肝组织蛋白有73种完全匹配，不匹配的点为45种。将这些蛋白进行糖基化位点预测，并应用生物信息学对这些蛋白进行分类，发现它们大部分都具有潜在的N-糖基化位点，在胞浆、胞膜及胞核中均有不同程度的分布，参与体内代谢和细胞粘附及细胞运动过程。与Con A结合型糖蛋白相比较，定位在内质网指导蛋白质折叠的分子伴侣类蛋白质较多。结论：(1)亲和层析、2-DE、MP技术、MALDI-TOF-MS／MS四者结合及亲和层析—二维色谱—电喷雾质谱分析是相对稳定的高通量、糖蛋白质组学共性技术平台。二维色谱可用于小样本的蛋白质糖基化修饰谱研究。(2)本研究建立了人健康肝及肝癌组织DSA结合型糖基化蛋白数据库，用两种方法共鉴定出人健康肝组织DSA结合型糖蛋白118种，通过2D-LC-ESI-MS共鉴定人肝癌组织DSA结合型糖蛋白98种。生物信息学分析发现DSA结合型的多天线结构的糖蛋白对于细胞的识别黏附、蛋白质的折叠转运等方面有着非常重要的作用。目的：通过差异荧光凝胶电泳(DIGE)技术比较研究健康肝和人肝癌细胞组织中DSA结合型糖基化蛋白质表达谱的改变，筛查在肝癌发生中起重要作用的关键DSA结合型糖基化蛋白质分子，验证其表达水平及推断糖链结构改变，为肝癌癌变机制性研究奠定理论基础。为疾病相关分子的糖蛋白质组学研究提供技术手段。方法：从人健康肝组织及肝癌组织中提取总蛋白，通过蔓陀萝凝集素(DSA)亲和柱层析分离和浓集DSA结合型糖基化蛋白质，分别以cy3和cy5荧光标记，以cy2做内标，通过差异荧光凝胶电泳技术在同一块胶上进行分离，利用荧光扫描仪473、532、635三个通道进行扫描获得的糖蛋白表达谱图像经Decyder 2D 6.5软件凝胶图像分析软件进行点识别、背景消除、点匹配及差异蛋白质分析，后续跑胶进行糖蛋白染色并挖点MALDI-TOF-MS质谱鉴定。结合第二部分利用2D-LC-ESI-MS鉴定出的差异蛋白按照功能及参与通路进行生物信息学分析，并对一种差异蛋白波形蛋白Vimentin异常DSA糖基化进行再验证；应用免疫印迹分析其蛋白表达情况；应用免疫沉淀结合多种凝集素亲和印迹检测这些蛋白与肝癌发生相关的其他糖链结构改变。结果：双向电泳结束后，473、532、635三个通道进行扫描获得的内标图谱、人健康肝组织DSA结合型糖蛋白表达谱、肝癌组织DSA结合型糖蛋白表达谱用分析软件(Decyder 2D 6．5)进行批量分析，人健康肝组织中被检测到的蛋白质点308±15个，肝癌组织中检测到的有353±26个点。其中相匹配(所有图谱共有的)有266个，不能相匹配的检测点有41个，被认为是杂质微粒或者由实验所带来的随机误差。差异大于1.4倍以上的蛋白点有30个，经质谱鉴定出的差异蛋白点有26个，16个是在肿瘤中上调。综合前面通过2D-LC鉴定出的差异蛋白进行生物信息学分析，发现在差异蛋白中以定位在内质网或高尔基体中具有分子伴侣功能，并指导蛋白质的正确折叠及翻译后修饰或与内质网应激相关的蛋白为最多。选择Vimentin进行异常DSA结合型糖基化再验证，它们在肝癌组织提取的DSA结合型糖基化蛋白中表达水平较正常肝组织要高。凝集素亲和印迹法对Vimentir进行糖链结梅推断，发现Vimentin对Con A、DSA、LCA都具有亲和力。且在肝癌组织中对DSA和Con A的亲和力要增强。结论：(1)凝集素亲和层析结合DIGE技术联合MALDI-TOF-MS／MS分析是相对稳定的高通量、高灵敏度的比较糖蛋白质组学共性技术平台。(2)16种DSA结合型糖基化蛋白质的异常与肝癌发生呈正相关。(3)Vimentin含有高甘露糖型、多天线型及核心岩藻糖型糖链结构形式，在癌变的发生发展过程中伴随着Vimentin的天线数增多。潜在应用价值1人健康肝组织Con A和DSA结合型糖基化蛋白质数据库的建立，为机体正常状态下糖蛋白的全面阐述及Con A和DSA糖基化功能作用探讨提供了基本的生物学信息。2筛检出的异常DSA糖基化的蛋白质有望可能成为肝癌发生的诊断标志物及预后判断指标，以丰富肝癌诊疗指标的选择与组合。创新性1．建立基于2D-LC和2D-DIGE的两种相对稳定、标准的高通量糖蛋白质组学共性技术平台，为与疾病发生、发展中相关的糖蛋白质组学研究奠定基础。2．本研究首次建立正常人健康肝组织Con A和DSA糖基化蛋白质数据库，并通过生物信息学分析展示其功能。3．波形蛋白Vimentin的糖基化修饰形式及与肿瘤的关系均为首次报道。中图分类号：R735．7；Q51：Q71