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第一章质粒及病毒的鉴定目的：检测重组质粒构建的正确性以及其表达目的蛋白的情况,了解包装的重组病毒的生物学活性。方法：1.用限制性内切酶(XbaⅠ、BamHⅠ)对重组质粒(pAAV-FGF21、 PAAV-FGF21-GLP1)进行酶切,凝胶电泳检测其产物大小。2.用重组质粒(pAAV-FGF21、pAAV-FGF21-GLP1)转染HEK293细胞,收集其细胞培养上清,用Western Blotting及ELISA检测其中FGF-21及GLP-1蛋白的表达。3.用rAAV-mCherry体外感染HepG2细胞,在荧光显微镜下观察荧光蛋白表达以检测其生物学活性。结果:1.pAAV-FGF21经酶切后,能检测到两条带,分子量分别为5200bp和630bp左右,符合AAV载体片段和FGF21片段大小；pAAV-FGF21-GLP1经酶切后,能检测到两条带,分子量分别为5200bp和780bp左右,符合AAV载体片段和FGF21+GLP1片段大小。2.经pAAV-FGF21转染后的细胞培养上清中能检测到FGF-21蛋白；经pAAV-FGF21-GLP1转染后的细胞培养上清中能检测到FGF-21蛋白和GLP-1蛋白。3.用rAAV-mCherry感染细胞后可在荧光显微镜下观察到红色荧光。结论：重组质粒(pAAV-FGF21、pAAV-FGF21-GLP1)构建正确,并且能在体外介导相应目的蛋白的表达。包装的重组腺相关病毒具有生物学活性。第二章重组AAV对2型糖尿病小鼠的治疗目的：评估rAAV-FGF21、rAAV-FGF21-GLP1对2型糖尿病小鼠的治疗效果。方法：对db/db小鼠进行空腹血糖及空腹胰岛素测定,以空腹血糖及HOMA-IR升高作为2型糖尿病成模标准。2型糖尿病db/db/、鼠随机分成4组,予以不同处理：A组(生理盐水)、B组(空载体rAAV-mCherry)、C组(rAAV-FGF21)、D组(rAAV-FGF21-GLP1);正常C57/BL6小鼠作为H组(生理盐水)。监测各组小鼠空腹血糖、体重、进食量、空腹胰岛素。治疗10周后处死小鼠,取肝脏组织用RT-PCR检测目的基因的表达,取胰腺组织用免疫荧光检测胰岛β细胞数量。结果：1.实验中所有db/db小鼠均有高血糖及胰岛素抵抗。2.与A组相比,D组小鼠空腹血糖、体重、进食量、空腹胰岛素明显下降(P<0.01),而B组、C组则无明显变化。3.在C组、D组小鼠肝脏组织中能检测到相应的转导目的基因的表达。4.免疫荧光检测显示,与A组相比,D组小鼠胰腺组织中荧光细胞数量较多,荧光强度较高,B、C组无明显变化。结论：1.实验中db/db小鼠均能在8周内自发形成2型糖尿病模型。2.rAAV-FGF21、rAAV-FGF21-GLP1能够携带其目的基因在小鼠肝脏表达。3.rAAV-FGF21-GLP1对db/db小鼠可起到降低血糖、减轻体重、减少进食量、降低空腹胰岛素、增加胰岛β细胞数量的作用。