研究背景和目标原发性肝癌是全世界泛发肿瘤之一,恶性程度高,严重威胁人类健康。在影响人类健康的十大肿瘤中,消化系统肿瘤就占到5席且排位均较靠前,且其中肝癌死亡率位列胃癌、食管癌之后居第三位。我国更是肝癌的高发区,每年死于肝癌的人数,约占全世界肝癌死亡人数的近50%。国际医学专家普遍预计,到2015年全球因癌症致死的人口将达到900万,并在2030年达到1140万。经多年研究,肝癌的治疗虽然已经取得长足的进步,但包括多激酶抑制剂索拉菲尼在内目前尚无根本性治疗措施出现。肝癌的发病常常很隐匿,早期无明显临床症状,且该病常进展迅速,导致肝癌确诊时大多数患者已经达到进展期或晚期肝癌,预后很差。我国肝癌90%以上为原发性肝细胞癌,其病因在我国主要是与乙肝病毒感染相关,提示肝癌的发生和受到乙肝病毒DNA干扰造成基因不稳定有直接关系。肝炎、肝硬化、肝癌常常是肝病患者的三步曲,故此肝癌患者诊断后常因合并肝硬化或者肝功能失代偿而丧失手术机会。因此积极治疗肝炎、改善肝功能以及定期查体是肝病患者的重中之重。肝癌之所以多数继发于肝炎,主要是由肝炎病毒所带来的分子机制决定的。HBV编码的多个基因激活肝细胞内多种信号转导通路及激酶,比如PI3K-Akt、MAPK、SAPK/JNK-κB等多环节产生刺激,这些环节被激活后又相互影响,使得肝脏正常细胞生长转化效应逐级放大,最终引发肝癌的形成。信号传导通路非常重要,无论是在肝癌的发生、发展过程中,还是在未来针对肝癌的生物治疗过程中。这些年来,分子生物学、基因组学以及蛋白质组学的研究有了突飞猛进的发展,多个分子靶向药物逐步研制成功并投入临床应用。所谓分子靶向药物即以肿瘤细胞的关键基因、过度表达的受体或者某些专有标志性分子为靶标,选择针对性的阻断剂或抑制剂,有效干预受上述关键基因、标志性分子调控或密切相关的信号传导通路,从而抑制肿瘤生长、进展或转移。例如索拉菲尼,是近些年研制成功的一种多激酶抑制剂,它在控制肿瘤增殖,预防和延缓复发、转移以及提高生活质量等方面有独特的优势,对失去手术机会的晚期肿瘤患者意义重大。索拉菲尼的出现极大鼓舞了医学工作者,但是其疗效在某种程度上来说也是有限的。一项研究表明,晚期肿瘤患者服用索拉菲尼相对安慰剂患者只延长了约1.4个月。其受限的有效性也时刻提示我们,持续寻找肝癌发生、发展中的信号传导网络及其关键控制节点是我们继续努力的方向。寻找新型生物治疗药物阻止肝癌的启动和发展这一新型治疗模式给肝癌标准化治疗带来光明前景。低端生物如果蝇、酵母中存在着沉默信息调节蛋白2(silent information regulator2,Sir2),被认为是调控物种衰老的重要因子。其在哺乳动物中也存在类似物,即Sirtuin (SIRT)家族。Sirtuins为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性的组蛋白去乙酰化酶。Sirtuin家族包括7个成员(SIRT1-7),各个成员在组织细胞内定位和功能各不相同。它们分布广泛,功能复杂多样,在细胞增殖、多种物质代谢、衰老调控、肿瘤生长调控等多个方面发挥重要作用,其中以SIRT1和SIRT2研究为多。SIRT6是一种研究较少的核Sirtuin的成员,但它又是其中重要的一份子,目前研究也逐渐多了起来。SIRT6与SIR2同源率只有25%,因此功能差异亦可能较大,所以很可能其功能不同于SIR2的以去乙酰化作用为主。当时人们普遍认为SIRT6去乙酰化能力微弱或不具备,仅具有ADP-核酸转移酶活性。但随着SIRT6的研究一步步深入,其去乙酰化作用底物逐步被发现,其所具备的去乙酰化功能也逐步得到认可。所以说,SIRT6是功能多样且重要的因子,同时具有乙酰化酶活性和ADP-核酸转移酶活性,尤其在肿瘤生长调控方面,其重要性被认为仅次于SIRT1,在基因损害修复、稳态的维持、部分肿瘤发生、发展的抑制方面都有重要作用。同时,SIRT6在调节代谢方面也有重要作用,比如脂肪代谢、糖代谢甚至骨代谢方面都有重要的贡献。已有资料证明SIRT6是一个肝脏葡萄糖稳态的主控调节者,通过影响DNA损伤修复过程来实现基因组稳定的维持。它可能根据基因不同的损伤方式,比如双链DNA损伤和单链DNA损伤,SIRT6均可以通过不同的途径产生针对性的处理,比如通过BER或者NER的方式参与基因的修复。这一系列的作用机制在预防机体衰老和预防机体瘤变倾向方面具有重要作用。所以,SIRT6在肿瘤的防治中发挥了一定的作用,而这种作用及机制目前尚没有完全得到阐述。一组研究确认,敲除鼠SIRT6后在体内增加了肿瘤的数量,大小,和侵略性。而Min等发现SIRT6对肿瘤有抑制作用,机制可能是对survivin的SIRT6依赖抑制作用是通过提供AP-1的结合位点诱导的肿瘤抑制来实现的。然而,也存在另外一些不同的结论。有实验室证据表明,SIRT6可能是在胰腺癌和乳腺癌中具有致瘤作用。所以,SIRT6在癌症的确切作用仍在研究中。在本研究中,为了解SIRT6在肝癌中的是否具备调控作用以及机制,我们以离体和在体两种情况对SIRT6在肝癌中的表达、调控及其影响机制进行了初步探讨。目的探讨SIRT6在原发性肝癌组织对比癌旁正常组织中的表达变化,并分析其在肝细胞癌中的意义；观察SIRT6的表达变化对HepG2细胞生长繁殖变化的影响情况,通过离体细胞研究方法,分析其所产生的试验结论所发生的分子机制,探讨其潜在的临床价值。方法首先采用RT-PCR和Western blot实验方法检测并分析肝癌组织、癌旁正常肝组织中SIRT6的mRNA水平和SIRT6蛋白的表达水平,以期了解SIRT6在肝癌发生发展中发生的变化,从而了解SIRT6在肝癌发病机制中所扮演的作用。其次,提取小鼠组织SIRT6mRNA,反转录获得cDNA文库。后用PCR技术扩增SIRT6的全长DNA。将SIRT6的全段PCR产物亚克隆到pacAd5CMV-IRES载体。然后,pacAd5CMV-IRES SIRT6和pacAd5的骨干载体由PaCⅠ线性化,将纯化的线性化质粒用转染试剂转染到HEK293细胞中,用HEK293细胞来生成腺病毒,得到Ad-SIRT6。同理得到SIRT6的RNA干扰产物Ad-SIRT6-shRNA和对照物Ad-GFP。使基因重组产物感染HepG2细胞,了解SIRT6对HepG2细胞的增殖效果。再次,我们对上述重组HepG2细胞进行TUNEL分析以了解SIRT6对HepG2细胞凋亡的影响情况。并且,我们检测ROS以及超氧阴离子水平用以研究SIRT6的过度表达对HepG2肝癌细胞氧化应激的影响。同时,又通过探讨SIRT6与细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的关系来探索其调节肝癌细胞生长的分子机制。结果1. RT-PCR检测结果对比4对癌和癌旁组织中SIRT6的mRNA表达,癌组织的mRNA表达量明显下调(35～40%,P<0.05),具有统计学意义。2.免疫印迹法检测结果对比4对肝癌及其癌旁组织中SIRT6蛋白的表达量(SIRT6/β-actin),癌组织中SIRT6蛋白量明显低于邻旁组织,差异均具有统计学意义。3. SIRT6基因真核表达载体构建成功,为试验的开展打下了坚实的基础。4.接下来我们测试明显降低或过度表达的SIRT6水平在体外环境下是否可以影响肝癌细胞的生长。腺病毒介导的经sh-RNA作用的SIRT6水平下降促进肝癌细胞的生长,而腺病毒介导的过度表达的SIRT6显著抑制HepG2细胞生长。5.我们研究SIRT6的过度表达对肝癌细胞凋亡的影响。首先,我们用TUNEL法分析了Ad-GFP和Ad-SIRT6转染的HepG2细胞。凋亡细胞在Ad-SIRT6感染细胞能检测到,但在对照的Ad-GFP细胞内却变化不大。我们还分析了活化型半胱天冬酶-3的蛋白表达水平,它是细胞凋亡中一种重要的介质和标记蛋白。活化型半胱天冬酶-3在SIRT6高表达的细胞内表达阳性,但在对照细胞内无表达。这些结果清楚地表明,过度表达的SIRT6对HepG2肝癌细胞诱导细胞凋亡。6.我们研究SIRT6的过度表达对HepG2肝癌细胞氧化应激的影响。DCF法检测表明,过度表达SIRT6显著降低HepG2细胞中总ROS水平。此外,过度表达的SIRT6在HepG2细胞中下调超氧阴离子水平。7.细胞外信号调节激酶(ERK1/2),是一个主要的细胞外促有丝分裂信号的换能器,能促进细胞增殖。我们分析SIRT6的过度表达对ERK1/2磷酸化的影响。结果显示,过度表达SIRT6在肝癌细胞中显著抑制ERK1/2磷酸化。8.为了解SIRT6是否通过调节ERK1/2信号通路抑制肝癌细胞的生长,我们用ERK1/2通路的化学抑制剂U0126处理HepG2细胞。U0126显著减弱SIRT6对肝癌细胞生长的抑制效果。结论肝癌组织中SIRT6的转录mRNA和蛋白表达明显下降,低于癌旁正常组织。SIRT6基因表达下降后能促进HepG2肝癌细胞株的生长,而SIRT6的过度表达则对HepG2细胞系的生长有抑制作用。过表达SIRT6诱导HepG2细胞凋亡,已经在TUNEL法和活化型半胱天冬酶-3免疫印迹中得到证明。此外,SIRT6的过度表达减少细胞内活性氧自由基和超氧阴离子水平。最后,SIRT6过度表达抑制ERK1/2的磷酸化,且应用化学特异性抑制剂U0126阻断ERK1/2通路能极大衰减肿瘤对SIRT6过度表达的抑制效果。研究结果表明,在肝癌组织中SIRT6表达明显下降,而SIRT6的表达增强会抑制肿瘤细胞的增殖,其发挥该抑制作用的机制可能是通过诱发癌细胞凋亡、抑制氧化应激以及抑制ERKl/2的磷酸化而产生。这些结果提示SIRT6在肝癌的发生、发展过程中发挥了一定程度的调控作用。