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本试验以罗曼鸡和寿光黑鸡胚胎性腺为实验材料,分别制作18-28期鸡胚的石蜡组织切片和18-28期鸡胚性腺细胞涂片,并进行PAS、Hoechst33258染色,观察和比较gPGCs在正常组织与消化分离后的形态结构特征。同时对18-28期胚胎gPGCs进行消化分离、纯化及培养。在此基础上,用纯化的gPGCs在不同的培养体系中培养。本研究的目的旨在明确鸡胚原始生殖细胞(gPGCs)在迁入生殖原基之后的形态学与分布特征,掌握有效的分离gPGCs的方法,探索gPGCs体外培养的影响因素及有效地培养条件,为发展鸡gPGCs的体外操作技术奠定基础。试验结果如下:
Ⅰ.PGCs形态学研究组织切片观察表明,gPGCs呈圆形或卵圆形,有伪足,直径为10μm-15μm,胞核呈圆形或椭圆形,偏向细胞边缘,大小为5μm-7.5μm。核内缘有少量异染色质,常染色质均匀分布。细胞悬液涂片观察表明,游离的gPGCs呈圆形或卵圆形,有伪足,周围有明显的光环;直径为12.5μm-20μm,PAS反应呈阳性。Hoechst33258染色后可见其胞核呈肾形或椭圆形,偏向细胞的边缘,大小为5μm-7.5μm×12.5μm。核内缘有少量异染色质,常染色质均匀分布。另外,可见27期鸡胚性腺中部分PGCs仍处于分裂状态,其胞体为12.5μm×32.5μm,Hoechst33258染色后,可见核位于中央且均等分布于赤道面两侧,大小为7.5μm×12.5μm。
Ⅱ.PGCs分布特点组织切片观察表明,gPGCs刚迁入性腺时,均等分布于两侧。22-23期gPGCs开始由右侧经背肠系膜向左侧迁移。27期时,靠近左侧性腺的背肠系膜边缘仍有部分PGCs,呈单个或成群分布。此时,左侧性腺gPGCs数目明显多于右侧。且gPGCs大部分位于性腺的皮层。说明27期为gPGCs从右侧性腺向左侧迁移的最后时期。
Ⅲ.生殖原基中PGCs增长变化趋势分离18-28期罗曼鸡和寿光鸡胚胎性腺PGCs,并计数作统计分析。发现:gPGCs在性腺中主要有两个快速增长期:18-19期和23-27期。28期时,每只罗曼鸡胚胎gPGCs个数显著高于寿光鸡。这可能是导致罗曼鸡产蛋率高于寿光鸡的原因之一。
Ⅳ.PGCs的分离纯化28期时,每只罗曼鸡胚胎获得gPGCs为1745.07±306.5,占1.98%。每枚寿光鸡胚胎可获得gPGCs1401.80±289,占1.61%。将酶解法分离后获得的性腺混合细胞培养24h,重新悬浮后将部分贴壁的基质细胞除去,每枚罗曼鸡可获PGCs512.5±104.2个,寿光鸡胚胎个数为:432.5±106.5。Ficoll分离后,每只罗曼鸡和寿光鸡胚分别可获得435.5±120.5和356.7±103.5个PGCs,分别占2.07%和1.87%。
Ⅴ.PGCs的培养研究28期胚胎性腺消化分散后,将PGCs分别培养于由添加bFGF和未添加bFGF的基础培养基和无饲养层和以鸡胚成纤维细胞为饲养层组成的四个培养体系中,结果发现,添加bFGF,可显著提高gPGCs的存活率,以CEF为饲养层并添加bFGF培养基可显著提高存活率和促进生长。