[背景及目的]准分子激光表层角膜切削术(surface ablation)包括准分子激光角膜切削术(photorefractive keratectomy, PRK)、准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术(laser subepithelial keratomileusis, LASEK),微型角膜刀法准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术(epipolis laser in situ keratomileusis, Epi-LASIK),较准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis, LASIK)而言,更为安全,并且减少了术后像差。所以,表层角膜切削术受到越来越多的关注。但是,表层角膜切削术也有其目前无法避免的不足,即术后角膜出现上皮下基质表层的混浊,排列紊乱的胶原沉积,临床上称为角膜上皮下混浊(haze)。Haze是表层角膜切削术最常见的术后并发症,角膜透明度下降,可引起视力或视觉质量下降、屈光回退。既往研究表明haze的产生与角膜创面的愈合过程和角膜细胞的反应直接相关。角膜创面的愈合过程是由多种细胞因子、生长因子和趋化因子介导的级联反应。该级联反应刺激角膜基质细胞发生凋亡,继而诱发周围基质细胞移行、活化、增殖,并向肌成纤维母细胞转化,同时分泌大量细胞外基质,大量排列紊乱的胶原物质,以Ⅲ型胶原纤维为主,无规律沉积于角膜上皮下,即形成haze。所以抑制角膜基质细胞的移行、活化、增殖和转化,减少胶原物质的产生是控制haze的关键。而在haze形成过程中的角膜基质细胞的增殖与纤维化与TGFβ的关系最为密切,阻断TGFβ的作用是减少角膜增殖与纤维化,抑制haze的关键。在TGFβ信号传导过程中,Smad7作为TGFβ受体后下游的抑制型信号传导因子,起着至关重要的作用。Smad7可以通过自分泌负反馈环来控制TGFβ信号的强度和持续时间。为了探讨Smad7基因治疗是否能减少角膜愈合过程中基质细胞的增殖与纤维化,本研究选择Smad7作为外源性目的基因,选用转染效率高、免疫原性低、较为安全的第三代慢病毒作为载体,构建Smad7慢病毒载体,将Smad7基因导入体外培养的大鼠角膜基质细胞和PRK动物模型角膜组织内,通过检测TGFβ的激动型信号传导因子的活化程度,角膜细胞的活化增殖和转化指标,胶原的合成情况,研究Smad7基因对角膜增殖和纤维化的作用,为基因治疗角膜haze,乃至其它角膜瘢痕,探索新的途径。[方法]一、大鼠Smad7基因慢病毒载体的构建与鉴定根据大鼠Smad7基因全序列,设计特异性引物,以大鼠大脑皮层和肾脏总RNA为模板,通过逆转录PCR扩增获得大鼠Smad7 cDNA片段,克隆入pcDNA-copGFP Lentivector质粒进行测序。将Smad7重组质粒转导入293细胞中,观察GFP的绿色荧光,并用real-time PCR和western blot方法检测Smad7在真核细胞中的表达。鉴定后包装成smad7’慢病毒重组载体Lv-Smad7。同法构建无Smad7外源基因的空质粒慢病毒载体Lv-plasmid作为对照病毒。二、体外Smad7慢病毒对角膜基质细胞增殖与纤维化的抑制作用培养大鼠角膜基质细胞,感染Lv-Smad7后检测Smad7的表达,建立Smad7阳性细胞克隆。同样方法建立空质粒阳性细胞克隆。进行分组：①正常细胞组：正常基质细胞,不加TGFβ2;②TGFβ2对照组：正常基质细胞加TGFβ2共孵育；③空质粒组：感染Lv-plasmid的阳性细胞,加ITGFβ2共孵育；④mad7组：感染Lv-Smad7的阳性细胞,加TGFβ2共孵育。TGFβ2的终浓度为10ng/ml。在TGFβ2刺激2h后Western blot法检测磷酸化Smad2蛋白(phosphorylated Smad2, p-Smad2)。TGFβ2刺激48h后Western blot和real-time PCR法检测α-SMA (α-smooth muscle actin)、Ki67 mRNA和蛋白的表达,Ⅲ型胶原蛋白(TypeⅢcollagen, ColⅢ) mRNA的表达。MTT法检测基质细胞生长活性。三、体内Smad7慢病毒对角膜增殖与纤维化的抑制作用SD大鼠96眼(右眼)随机分为4组：①假手术组：刮除角膜上皮,不予以激光切削；②手术组：行PRK手术,即刮除角膜上皮,并予以激光切削；③空质粒组：行PRK手术,并予LV-plasmid滴眼；④mad7组：行PRK手术,并予LV-Smad7滴眼。病毒液滴眼时间为手术当天及术后1w内每日1次,以后每周1次。于术后1d、1w、lm、3m采集角膜标本。real-time PCR检测角膜组织中Smad7、TGFβ2.α-SMA. Ki67, colⅢmRNA的表达,Western blot法检测角膜组织中Smad7和p-Smad2的表达。[结果]一、大鼠Smad7基因慢病毒载体构建成功通过PCR扩增获得1.3kb Smad7 cDNA片段,与载体连接成Smad7重组质粒。测序结果与GenBank序列一致。Smad7重组质粒和空质粒分别进行慢病毒包装后获得Lv-Smad7和Lv-plasmid,病毒滴度约为1.0X104ifu/μl.二、体外Smad7慢病毒对角膜基质细胞增殖与纤维化的抑制作用(一) Smad7基因在角膜基质细胞内的表达测定Lv-Smad7体外感染角膜基质细胞后,检测结果表明Smad7在转录和翻译水平上的表达均明显增强,证实Lv-Smad7成功感染基质细胞,并能在细胞内高效表达。(二) p-smad2蛋白的Western blot检测结果Smad7组p-Smad2蛋白量较空质粒组下降,而TGFβ2对照组较正常细胞组增加。(三) ColⅢα1链mRNA的real-time PCR检测结果结果显示,TGFβ2可以促使正常角膜基质细胞合成colⅢ增加,TGFβ2对照组与正常细胞组比较P<0.05；而导入Smad7后,colⅢα1链mRNA的表达受到抑制,Smad7组为空质粒组的38.3%,Smad7组与空质粒组比较P<0.05。(四)α-SMA和Ki67 mRNA和蛋白表达的检测结果TGFβ2可使角膜基质细胞内α-SMA和Ki67的mRNA和蛋白的合成均增多(P均<0.05),而导入Smad7后,α-SMA和Ki67的合成均受到抑制,Smad7组与空质粒组比较,差异有显著性意义(P均<0.05)(五)MTT法检测细胞生长活性结果TGFβ2促进角膜基质细胞增殖；而Smad7可阻断这种作用,使细胞生长活性减弱,Smad7组与空质粒组比较,差异有显著性意义(P均<0.05)三、体内Smad7慢病毒对角膜增殖与纤维化的抑制作用(一) Smad7 mRNA和蛋白在角膜组织中的表达real-time PCR和Western Blot结果显示各时间点Smad7 mRNA及蛋白表达量Smad7组较空质粒组增高(P均<0.05),1m达高峰,3m时仍持续高表达。(二)角膜组织中p-Smad2蛋白的Western blot检测结果术后1d起手术组p-Smad2的表达即开始增高,并持续至3m,与假手术组比较差异有显著意义(P均<0.05)。而Smad7组与空质粒组比较,在1w、1m、3m时pSmad2蛋白的表达量均下降,差异存在显著性意义(P均<0.05)(三) TGFβ2,α-SMA、Ki67、colⅢmRNA的检测结果①术后1w、1m、3m时TGFβ2 mRNA的表达于术组较假手术组增高,差异存在显著性意义(P均<0.05)；而Smad7可减少TGFβ2合成,同时间点Smad7组较空载质粒组TGFβ2明显减少(P均<0.05)②术后1w起α-SMA mRNA的表达开始增高,1m为高峰,持续至3m仍有较高表达(P手术组vs假手术组均<0.05)；而Smad7组与空质粒组比较,在1w、1m、3m时α-SMA mRNA的表达均下降,分别为空质粒组的82.7%、67.6%和59.5%(P均<0.05)。③术后1d起手术组Ki67 mRNA的表达即增高(P组2vs组1<0.05),1w及1m为高峰,3m时Ki67的表达量较1m时下降(P3mvs1m<0.05)。Smad7组1w、1m、3m时Ki67mRNA的表达均较空载质粒组减少(P均<0.05)④colⅢmRNA的表达术后1w起手术组开始增高,1m为高峰,持续至3m仍有较高表达,与假手术组比较差异有显著意义(P均<0.05)。而同时间点Smad7组与空质粒组比较,在1w、1m、3m时colⅢmRNA的表达量均下降(P均<0.05)。[结论]一、Smad7慢病毒重组载体构建可行,在大鼠角膜体内外可高效表达。二、体外研究表明Smad7基因导入大鼠角膜基质细胞可阻断TGFβ信号传导通路,减少smad2的磷酸化,阻止基质细胞的活化增殖,阻断基质细胞向肌纤维母细胞的转化,并且减少胶原蛋白Ⅲ的合成,从而抑制角膜基质细胞增殖和纤维化。三、体内研究表明Smad7基因治疗可降低大鼠角膜内TGFβ2 mRNA的表达,减少smad2的磷酸化,阻止角膜细胞的活化增殖,阻断角膜细胞向肌纤维母细胞的转化,并且减少胶原蛋白Ⅲ的合成,抑制角膜的增殖和纤维化。四、Smad7基因治疗可望在表层角膜切削术后减少haze的形成方面发挥作用,在减轻其它角膜病变的瘢痕形成中也可能具有作用,值得进一步研究。