小球藻(Chlorella vulgar is)是一类单细胞淡水绿藻,含有丰富的营养物质和活性成分。各种临床研究表明小球藻具有显著的抗肿瘤、抗氧化、抗菌以及抗炎症等活性,对人体健康非常有益。逆流色谱(CCC)是一种不用固相载体的液-液分配色谱技术,具有分离量大、分离环境温和、回收率高、溶剂消耗少等优点,在天然生物活性物质的分离纯化中具有独特的优势。本论文采用逆流色谱技术,针对小球藻中的低极性化学组分如类胡萝卜素、植物甾醇等建立了几种新型分离制备方法,主要研究内容和结果如下：1、采用正己烷-乙醇(1：1,v/v)溶剂体系超声提取小球藻中的低极性组分,并通过皂化处理去除叶绿素及脂肪酸等杂质,获得小球藻皂化提取物。本实验分别针对其中主要成分,如类胡萝卜素和植物甾醇等物质建立了超高效液相色谱分析方法。2、建立了小球藻中叶黄素的逆流色谱分离方法。采用正己烷-乙醇-水(4：3：1,v/v)溶剂体系,成功从100mg小球藻皂化提取物中一步制备分离30.7mg叶黄素,纯度达94.1%。实验对比研究了逆流色谱与半制备型高效液相色谱,结果表明逆流色谱具有分离量大、产率高、溶剂消耗少等优点,是一种高效、经济的制备型分离方法,非常适合食品中活性物质的分离提取。3、设计开发了绿色、环保、纯天然的柠檬烯-乙醇-水体系作为逆流色谱溶剂体系,建立了小球藻中叶黄素的新型绿色逆流色谱分离方法。实验通过研究柠檬烯、正己烷等溶剂的理化性质和柠檬烯-乙醇-水溶剂体系的三元相图,得出柠檬烯可以代替正己烷作为逆流色谱溶剂体系；采用柠檬烯-乙醇-水(10：9：1,v/v)溶剂体系,成功从300mg小球藻超声提取物中一步制备分离得到20.4mg叶黄素,纯度达94.6%。实验结果表明本实验所建立的逆流色谱分离方法更绿色、环保。4、建立了小球藻中植物甾醇的闭合循环逆流色谱分离方法。实验采用正己烷-二氯甲烷-乙腈(10：3：7,v/v)溶剂体系,从300mg小球藻皂化提取物中制备分离得到40mg植物甾醇混合物；应用闭合循环逆流色谱,采用正己烷-二氯甲烷-乙腈(10：3：7,v/v)溶剂体系,成功从40mg植物甾醇混合物中制备分离得到24.3mg麦角固醇和13.7mg麦角固醇结构类似物,纯度分别达97.2%和96.4%。实验结果表明闭合循环逆流色谱能显著提高色谱分离度,非常适合分离小球藻中结构及性质均相似的植物甾醇类化合物。