白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF）是IL-6细胞因子家族中的一员，具有广泛的生物学功能。有报道称其在体外对HL-60、U937、M1细胞具有抑制增殖并诱导分化的作用。但白血病细胞增长快速且对LIF的感应能力差，使得机体内有限的LIF无法抑制白血病细胞的恶性繁殖，且外源性、非生理剂量的LIF会对正常细胞产生一定的毒性，并会干扰细胞因子间的相互调控，所以它不能直接应用于临床治疗。　　 LIF发挥其生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体来完成。LIF受体包括两个亚基，即LIFRα和gp130。其中，LIFRα由胞外区，跨膜区和胞内区组成。其中胞内区共有三个功能域(Box1、Box2和Box3)，其主要作用结构为YXXQ(Y为酪氨酸，X为任意氨基酸，Q为谷氨酰胺)，是激活细胞内信号分子的必须序列。本教研室前期工作中已证实，通过病毒转染的方式，将LIFRα胞内区含Box3功能域的C末端序列(LIFRα-CT3)过表达于HL-60细胞胞质中，可促进细胞朝成熟粒细胞方向分化，并抑制其增殖潜力。然而，脂质体或是病毒等转染方式只能应用于体外试验，在临床治疗上存在一定的限制。因此，我们借助蛋白质转导结构域（Protein Transduction Domain，PTD）能将全长蛋白质携带入细胞内的特性，采用CHO真核表达体系制备了LIFRα-CT3融合多肽(TAT-CT3)。实验结果表明该融合多肽确实能抑制HL-60细胞增殖，并向粒系分化。由于该表达体系获得的融合多肽存在表达量少、浓度低、成本高的特点，不利于今后对该蛋白与白血病细胞间的机制研究，所以要获得大量的、高浓度的融合蛋白TAT-CT3显得非常有意义。　　 信号转导和转录激活子(STAT3)参与细胞生长、分化、增生、恶性转化及凋亡机制。它能现有研究发现多种肿瘤中均存在STAT3蛋白的持续性高表达，参与了肿瘤的形成。因此，阻断JAK/STAT3通路已作为肿瘤治疗中的一个治疗靶点。而近几年的研究已证实STAT3的异常持续性活化与白血病的发生有着密切关系，因此我们推测STAT3磷酸化的降低与HL-60细胞分化存在着一定的联系。　　 MicroRNAs(miR)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它在细胞生长和分化过程中能调控基因的表达，并与肿瘤的发生有一定的联系。一些microRNAs已被证实为致癌性小RNA，与AML疾病的发生密不可分。在这些致癌性小RNA中，miR-155在血液系统恶性肿瘤组织中表达上调，同样也高表达于某些分型的AML白血病细胞中。miR-155位于B-cell Integration Cluster(bic)基因的第三个外显子内，它的表达水平受到BIC基因的转录和miRNA加工等调控。　　 虽然STAT3和miR-155分别被视作癌基因和致癌性小RNA，两者又都在白血病中存在高表达的现象，但是在对白血病的研究中，两者之间的关系的鲜有相关的文献报道。同时，C/EBPβ作为miR-155的下游靶基因，在粒系分化中有着重要的作用。因此，探索STAT3与miR-155之间的关系对研究TAT-CT3对HL-60细胞分化的作用机制是十分有必要的，并且也对靶向STAT3的肿瘤治疗有更多维的认识。　　 本课题的目的就是利用原核表达系统大量制备有活性的TAT-CT3融合多肽，观察其是否具备像真核表达的多肽一样对HL-60细胞的生长和分化有相似的作用，并研究在HL-60细胞分化过程中STAT3磷酸化水平以及miR-155表达的变化，并探讨两者在HL-60细胞分化中的作用及其相互关系。　　 在本实验中，我们应用原核表达系统获得高表达的带有SUMO标签的TAT-CT3蛋白，用FITC加以标记，以50μg/ml的浓度、作用HL-60细胞45分钟后，通过免疫荧光检测证实了TAT-CT3能够进入HL-60细胞内。接着，蛋白以10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml的浓度处理HL-60细胞4天后，经流式细胞仪分析发现，经50μg/ml的终浓度暴露的细胞，其细胞分化表面标志物CD11b表达增加最多，以此确定后续实验所需的最佳多肽剂量。之后以50μg/ml的终浓度作用24h,48h,72h，98h，分别检测细胞增殖以及CD11b/14的表达变化。实验结果表明原核表达的TAT-CT3融合蛋白具有和真核表达的蛋白一样，能抑制HL-60细胞增殖并诱导其向成熟粒细胞方向分化的作用。　　 为了进一步研究TAT-CT3在其抑制细胞增殖诱导分化的过程中，是否能降低STAT3持续性磷酸化水平以及miR-155的表达水平，以50μg/ml的TAT-CT3对HL-60细胞进行为期4天的暴露。通过Western Blotting以及qRT-PCR的方法检测，结果表明STAT3磷酸化水平在24h，48h,72h,98h后有所下降，miR-155及其前体BIC同样表达有所下降。miR-155其下游的靶基因有SOCS-1、C/EBPβ，SOCS-1是JAK/STAT通路的负调控因子，C/EBPβ在粒系细胞分化过程中有重要的诱导作用，因此我们在mRNA以及蛋白水平分别检测了它们表达情况，结果表明，随着多肽暴露时间的延长，SOCS-1以及C/EBPβ表达都有所上升。　　 在本教研室的前期实验中已证实在HL-60细胞的分化是通过激活和强化STAT3的磷酸化来实现的，这一结果与本课题中STAT3磷酸化的降低存在着矛盾。有研究表明IL-6通过激活STAT3的磷酸化诱导SOCS-1的表达，一旦SOCS-1表达上升，它作为JAK/STAT3通路的负调控因子又抑制STAT3的磷酸化。我们通过qRT-PCR以及Western Blotting检测发现，当加入TAT-CT3后，在0-2小时之间，STAT3磷酸化增加的同时伴有SOCS-1表达的上升，而在2小时后，STAT3磷酸化被SOCS-1抑制而降低，并低于未经TAT-CT3暴露前的磷酸化水平。这一结果说明TAT-CT3通过强化STAT3磷酸化水平促进了SOCS-1的表达，SOCS-1表达的升高反作用于STAT3，使其磷酸化降低。　　 SOCS-1表达增加伴随着STAT3磷酸化的增强，而SOCS-1是miR-155的下游靶基因，以此推测STAT3是作用于miR-155来调控SOCS-1的表达。并且STAT3作为信号转导和转录活化因子，当被激活后形成二聚体入核，可以调控基因的表达。因此对野生组以及TAT-CT3组HL-60细胞进行4天的连续暴露（50μg/ml，每日换液）后分别检测pSTAT3在转录因子启动子区的水平变化。CnIP实验结果表明，STAT3能够结合至BIC启动子区域。我们可以推断在多肽TAT-CT3加入至HL-60细胞培养基后，STAT3磷酸化一过性的增强促进其二聚体的形成并入核，结合至BIC启动子区抑制了miR-155的表达，从而促进SOCS-1的表达。　　 总之，本研究制备了有活性的原核表达的TAT-CT3融合多肽，它能够抑制HL-60细胞增殖并促进其向粒系分化。首次证明了STAT3能直接结合到BIC的启动子区，调节miR-155的表达，这也为靶向miR的肿瘤治疗提供一定的借鉴意义。