非标准氨基酸是一类非遗传编码的氨基酸。该类物质在生物医学和生物技术领域有着广泛的应用价值,如L-叔亮氨酸是合成抗肿瘤抑制剂、抗HIV蛋白酶抑制剂等多种药物的重要中间体。此外,某些非α-氨基酸（如γ-氨基戊酸）能参与构建特殊功能的活性肽。随着非编码氨基酸引入蛋白合成策略的发展,非标准氨基酸的应用范围得到进一步拓展,能参与构建更符合应用需求的人工酶。因此,开发多样的非标准氨基酸合成策略具有重要的科学意义和应用价值。生物催化合成手性氨基酸具有反应条件温和、环境友好、产物光学纯度高等特点。目前,酶法不对称合成手性氨基酸主要有四个途径,即氨基酸与醛的羟醛缩合途径、氨基不对称转移酮酸途径、氨与α,β-不饱和酸的对映选择性加成途径、酮酸的不对称还原胺化途径。其中,氨基酸脱氢酶（如亮氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶）催化的酮酸不对称还原胺化途径可以直接使用廉价的氨水作为氨基供体,原子利用率高,且产物的e.e.值可以超过99%,已被广泛用于高附加值的非标准氨基酸的合成。然而,这类酶催化合成的产物主要为α-氨基酸,对于非α-氨基酸的合成研究鲜有报道。本论文以亮氨酸脱氢酶（Bc LeuDH,源于Bacillus cereus）和谷氨酸脱氢酶（Ec Glu DH,源于Escherichia coli）为出发酶,对其进行底物特异性改造,提升了Bc LeuDH合成L-叔亮氨酸的催化效率,并成功构建出能不对称合成（R）-4-氨基戊酸的工程谷氨酸脱氢酶(Ec Glu DHK116Q/N348M)。主要研究结果如下:（1）利用NAD（P）H和2,4-二硝基苯肼（DNPH）的理化特征,建立了两种用于氨基酸脱氢酶催化活力检测的高通量筛选方法（DNPH检测法和NAD（P）H检测法）并对其有效性进行了评估。研究结果表明DNPH检测法适用于羰基化合物（酮酸,酮醇,酮）含量的快速检测,该方法廉价快捷,适用于较为庞大的突变文库的筛选工作;而NAD（P）H检测法需要添加昂贵的还原性辅酶,经济性不如DNPH检测法,但该方法的假阳性率只有0.3%,只有DNPH检测法假阳性率的0.36倍。两种高通量筛选方法优势互补,为之后的氨基酸脱氢酶底物特异性改造提供了有利条件。（2）通过两种高通量筛选方法的综合应用,确认了4株对三甲基丙酮酸催化效率提高的Bc LeuDH优势突变体（E116V、D126E、E24V/E116V和E24A/D126E）,其中最优突变体E24V/E116V对三甲基丙酮酸和NADH的kcat/Km分别为野生型Bc LeuDH的5.3倍和3倍。值得注意的是,突变体E24V/E116V对NADH显示出更好的亲和力,其Km值是野生型Bc LeuDH的0.3倍。通过反应条件优化,突变体E24V/E116V和葡萄糖脱氢酶构建的辅酶循环系统在低辅酶浓度（0.05 m M NAD+）条件下,75 min实现了0.57M三甲基丙酮酸的完全转化,比时空转换率和TTN分别达到了22.8 mmol·h-1·L-1·g-1和11400。此外,这些突变位点对基于Bc LeuDH构建的胺脱氢酶的活力提升具有借鉴意义。（3）为创制出能催化非α氨基酸的工程氨基酸脱氢酶,本研究设计了两种氨基酸脱氢酶底物特异性改造方案。方案一:将酶的底物主链特异性识别从羧基（COOH-）转变为COOHCH2-,构建出能催化β-氨基酸的氨基酸脱氢酶;方案二:将酶的底物主链特异性识别从羧基转变为甲基的同时,对酶的底物侧链特异性识别进行改造,使工程酶对侧链带有羧基的底物具有催化活力,从而构建出能不对称合成非α-氨基酸的工程氨基酸脱氢酶。基于Bc LeuDH锚定底物主链羧基的两个重要残基（K70和N263）,构建了两点的组合饱和突变文库,分别以3-氨基-5-甲基己酸和2-戊酮作为底物,对突变文库进行筛选,并成功构建了对2-戊酮具有催化活力的工程胺脱氢酶（Bc-LAm DH-M0,K70S/N263L）,其底物主链的特异性识别从原来的羧基转变为了甲基;在Bc-LAm DH-M0的基础上利用迭代饱和突变叠加优势突变点（24、116）,构建了催化活力提升的突变体Bc-LAm DH-M2（E24V/E116V）,其对2-戊酮的催化活力是出发菌株Bc-LAm DH-M0的2.2倍,且该突变体催化合成的产物（R）-2-氨基戊烷的e.e.值大于99%;在底物谱的检测中发现优势突变体Bc-LAm DH-M2对脂肪酮、脂环酮的催化活力得到了广泛的提升。在对Bc-LAm DH-M2的底物侧链特异性识别的分子改造中,并未成功获得对4-氧代戊酸（侧链带羧基的底物）具有催化活力的工程酶,这可能是由于LeuDH的活性中心具有较强的疏水性,难以在其中构建氢键网络。（4）本研究选择了具有亲水底物口袋的谷氨酸脱氢酶（Glu DH）来实施底物特异性改造方案二,尝试构建能催化β-氨基酸和γ-氨基酸的工程氨基酸脱氢酶。为选择合适的出发酶进行底物特异性改造,本研究通过对三种具有蛋白结构信息的Glu DH（源于Corynebacterium glutamicum的Cg Glu DH、源于Clostridium symbiosum的Cs Glu DH和Ec Glu DH）进行底物谱检测。相比于Cg Glu DH和Cs Glu DH,Ec Glu DH不仅对底物2-酮戊二酸(50.55 U·mg-1)和草酰乙酸(0.45 U·mg-1)具有更高的催化活力,甚至对侧链末端带有羟基的L-高丝氨酸(0.004 U·mg-1)具有可检测的催化活力。为提升Ec Glu DH对草酰乙酸的催化活力,本研究对Ec Glu DH底物侧链特异性识别进行改造,获得的最优突变体K92V对草酰乙酸的kcat和kcat/Km分别是野生型Ec Glu DH的9.7倍和40倍。（5）为构建能催化合成β-氨基酸和γ-氨基酸的工程氨基酸脱氢酶,本研究通过对Glu DH蛋白结构分析和序列比对确认了Ec Glu DH锚定底物主链羧基的两个关键残基,并构建了“小而精”的两点组合饱和突变文库,通过对底物4-氧代戊酸活力的筛选,成功获得了最优突变体Ec Glu DHK116Q/N348M,其对4-氧代戊酸催化活力可达108.6 m U·mg-1,且当该优势突变体与K92V叠加后获得的突变体Ec Glu DHK116Q/N348M/K92V对（R）-3-氨基丁酸产生了微弱活力(0.23 m U·mg-1)。在最优反应条件（1 m M NADP+,p H 8和45°C）的转化实验中,Ec Glu DHK116Q/N348M和甲酸脱氢酶构建的辅酶循环体系在11小时内将0.4M的4-氧代戊酸转化了97%,且产物（R）-4-氨基戊酸的e.e.值＞99%。