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FK506是一种广泛用于预防和治疗同种异体移植排斥反应的免疫抑制剂。目前临床上,心脏移植患者采用长期口服或静脉注射的方式给药,此类给药方式使药物全身分布,一方面不能使药物有效地集中于靶器官,二是产生全身器官的毒副作用。心脏移植术后,如何使免疫抑制剂局部释放于靶器官,是近年来的研究热点与难点。超声靶向微泡破坏(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)技术可使微泡在靶器官局部破裂,使药物在局部组织中浓聚。本研究旨在制备一种载FK506超声微泡(FK506-loaded microbubbles,FK506-MBs),在大鼠心脏移植模型上,通过超声波辐照移植心脏部位,靶向破坏FK506-MBs,实现药物靶向释放,提高移植心脏局部药物浓度,增强治疗效果,并可望减轻免疫抑制剂的毒副作用。本研究包括以下三个部分:第一部分FK506-MBs制备以及性质评价目的制备空白超声微泡(Blank microbubbles,Blank MBs)和载药微泡FK506-MBs,并评价其表征。方法(1)采用薄膜水化-机械振荡法制备FK506-MBs和Blank MBs,高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)检测FK506-MBs的载药量,并计算FK506-MBs的药物包封率和载药率。(2)使用粒径仪和血细胞计数板分别检测FK506-MBs和Blank MBs的粒径和浓度,光镜下观察两者的形态。(3)分别检测4℃和37℃条件下,FK506-MBs不同保存时间后的药物损失率,评价FK506-MBs的药物稳定性。(4)使用超声转染仪(NEPA GENE,日本)进行UTMD触发FK506-MBs释放药物,检测不同超声辐照时间下药物释放率。结果(1)FK506药物投放量为2 mg时,FK506-MBs的药物包封率为75.8±4.09%,载药率为33.48±1.21%。(2)肉眼观察FK506-MBs和Blank MBs均为乳白色混悬液,光镜下观察FK506-MBs和Blank MBs均呈现透光的圆形,无聚集现象。FK506-MBs和Blank MBs的粒径和浓度分别为1.65±0.32μm,(4.35±0.18)×109个/ml以及1.20±0.20μm,(5.71±0.15)×109个/ml。(3)在4℃和37℃条件下保存FK506-MBs,随着保存时间的延长,药物损失率增加。在4℃放置24 h,药物损失率为6.0±0.57%,37℃放置24 h后,药物损失率达到15.67±1.17%。(4)UTMD能触发FK506-MBs释放药物,超声辐照时间为2 min时,药物释放率为72±1.15%。结论本研究成功制备了具有较高药物包封率和载药率的FK506-MBs,能在4℃条件下稳定保存24 h。在UTMD介导下FK506-MBs能够高效释放FK506。第二部分大鼠心脏移植术后UTMD参数优化及安全性评价目的验证UTMD能够增加移植心脏血管壁通透性实现药物靶向递送,优化超声辐照参数,并评估MBs和UTMD的安全性。方法(1)制备大鼠腹腔异位心脏移植模型。经尾静脉注射Blank MBs,采用Sonitron 2000V超声转染系统,探头频率为1 MHz,进行UTMD。超声辐照参数如下:超声强度2 w/cm2,占空比为50%,设定超声辐照时间分别为1 min,2 min,3 min。辐照区域为腹腔移植心脏,对照组超声辐照时间为0 min。UTMD后立即注射Evans blue(EB)染液,观察不同超声辐照时间下移植心脏蓝染情况。(2)通过比较UTMD前后移植心脏心率变化,评价不同超声辐照时间下UTMD对移植心脏的损伤。UTMD后处死实验模型鼠,获取移植心脏标本,行HE(Haematoxylin and eosin,HE)染色,观察有无心肌组织损伤。(3)27只正常SD大鼠分成3组:PBS组(9只)、MBs组(9只)和UTMD组(9只)。MBs组只静脉注射Blank MBs。每组老鼠于干预后30 min,1 day,7 day随机取3只处死,获取老鼠的全血和心、肝、脾、肺、肾,进行血细胞分类计数分析、血清生化分析及器官HE染色,评价MBs和UTMD的安全性。结果(1)EB染色及定量结果显示,UTMD后超声辐照区域心肌组织蓝染明显,随着超声辐照时间的增加移植心脏蓝染面积增大和蓝染程度加深。(2)UTMD超声辐照时间为1 min和2 min时移植心脏UTMD后心率无明显改变,超声辐照时间为3 min时,UTMD后移植心脏心率明显下降。(3)UTMD超声辐照时间为1 min和2 min时,移植心脏未见明显心肌细胞坏死和心肌纤维异常改变,超声辐照时间为3 min时,HE染色显示心脏纤维出现轻微空泡样变。(4)MBs组和UTMD组老鼠与PBS组老鼠相比,血细胞分类计数,肝肾功能,心肌酶无明显异常改变,各重要器官HE染色也未见明显组织损伤。结论本研究证明,UTMD超声频率为1 MHz,超声强度2 w/cm2,占空比为50%,超声辐照时间为2 min时能够显著增强移植心脏血管通透性,且对移植心脏无损伤。第三部分FK506-MBs超声靶向释放抑制大鼠急性心脏移植排斥反应疗效评价目的验证FK506-MBs联合UTMD靶向给药治疗心脏移植急性排斥反应的有效性。方法(1)在大鼠腹腔异位心脏移植模型上,通过单纯注射给予Di R(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindotricarbocyaine iodide,Di R)和Di R-loaded microbubbles(Di R-MBs)+UTMD对移植心脏局部给予Di R,进行活体成像比较移植心脏的荧光强度,评价载药微泡联合UTMD靶向给药能够增加药物在移植心脏中浓度。(2)在大鼠腹腔异位心脏移植模型上,通过单纯注射给予Di I(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindotricarbocyaine perchlorate,Di I),和Di I-loaded microbubbles(Di I-MBs)+UTMD对移植心脏局部释放Di I,处死实验模型鼠,取得移植心脏,进行心肌组织切片染色,激光共聚焦显微镜下观察Di I在移植心脏中的荧光强度。(3)在大鼠腹腔异位心脏移植模型上,通过单纯注射给予FK506或FK506-MBs+UTMD在移植心脏局部释放FK506。30 min后处死模型鼠,取得移植心脏。使用超高效液相色谱-质谱联用仪(ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS)检测移植心脏中FK506浓度。(4)通过记录移植心脏的心率评价移植心脏的存活时间;通过HE染色评价急性排斥反应(Acute rejection,AR)程度;通过免疫荧光染色和western blot评价T淋巴细胞的浸润程度和IFN-γ及IL-2的分泌情况。结果(1)活体成像显示,静脉注射Di R和通过Di R-MBs+UTMD给予Di R后Di R分布于全身各器官,特别是在肝脏和脾脏分布较多。在30 min时移植心脏中的荧光强度最高;与Di R组相比Di R-MBs+UTMD组中移植心脏的荧光强度明显增高。(2)激光共聚焦显微镜显示Di I-MBs+UTMD组移植心脏心肌间质中可见红色荧光,而PBS组和单纯Di I组移植心的心肌间质中未见红色荧光显示。(3)FK506-MBs+UTMD给药后移植心脏中FK506浓度为3.17±0.38μg/g,单纯注射FK506给药后移植心脏中FK506浓度为1.93±0.29μg/g。(4)HE染色显示,FK506-MBs+UTMD给药组AR程度较其他组明显减弱。(5)免疫荧光染色和western blot检测显示,FK506-MBs+UTMD给药组移植心脏心肌间质中CD3阳性细胞浸润较其他组明显减少,IFN-γ和IL-2的分泌较其他组明显减弱。(6)生存期评价显示,PBS组移植心的生存期为6.66±1.36天,FK506组移植心生存期为12.83±1.17天,FK506-MBs+UTMD组移植心的生存期为16.00±0.89天,较其他组明显延长了移植心的生存时间(p<0.05)。结论本研究显示,FK506-MBs联合UTMD靶向给药明显提高移植心脏中的药物浓度,增强治疗效果,为治疗器官移植排斥反应提供了新思路。