[目 的]乙型脑炎为常见的蚊媒传播人兽共患病疾病,由乙脑病毒引起;病死率高,后遗症严重,近年来乙脑流行区域呈扩散趋势,对人类健康有着严重威胁。目前尚不完全了解乙脑病毒的毒力决定因素,因此对乙脑病毒基因组及蛋白分析是十分有必要的。本研究从一位重症乙型脑炎病毒感染患者的血清及脑脊液样本中分离得到一株乙型脑炎病毒,对其全基因组序列进行分析,并对其蛋白结构和功能以及蛋白的理化性质和分子功能等方面进行预测。为方便进一步鉴定预测的毒力相关位点是否真的会对乙脑病毒的毒力产生影响,我们以减毒乙脑病毒疫苗株SA14-14-2为模板构建了乙脑病毒疫苗株的全长感染性克隆,以助于后续对乙脑全长克隆质粒进行定点突变,观察突变株与疫苗株的复制能力及毒力差异,以研究及鉴定毒力位点。[方 法]在云南省西双版纳收集得到一位乙脑感染患者血清及脑脊液,将样品接种Vero细胞分离野毒株,对其进行了病毒RNA的提取、RT-PCR、测序,拼接获得其完整序列,并通过DNAMAN和MEGA6.0软件对其全基因组核苷酸及氨基酸序列进行分析,后通过ProtParam、PSIPRED、Phyre2和SWISS-MODEL软件对NS3和NS4A两非结构蛋白的结构和功能进行预测预测,找到两个可能的毒力相关位点。同时我们以乙脑疫苗株SA14-14-2为模板,进行设计、扩增、连接至pcr2.1质粒,通过体外转录的方法获得病毒RNA转录体,将转录体RNA转染至C6/36细胞中进行拯救,使病毒在细胞中包装成完整的、具有活性的病毒颗粒,然后观察其细胞病变效应,并通过间接荧光免疫评价其在细胞中蛋白表达能力,为后续毒力相关位点验证奠定基础。[结 论]研究中以血清及脑脊液中提取的病毒RNA为模板,共获得了 18段PCR产物,对扩增片段进行测序拼接获得乙脑病毒全长基因序列;将该序列与NCBI数据库中的43株序列的比对发现,病毒基因组全长序列和病毒蛋白序列分别与2008年和2016年中国猪分离株的病毒基因组全长序列和病毒蛋白序列非常相似,属于JEV GⅢ组。与相似株、疫苗株(SA14-14-2)及高毒力病毒株对比发现分别位于NS3和NS4A中的两个位点是值得关注;通过对两个分结构蛋白的理化性质、蛋白结构及分子功能预测分析发现,这两个位点确实对蛋白的功能及结构产生影响,可能是潜在的毒力相关位点。此外,我们通过同源重组的方法将减毒乙脑疫苗株SA14-14-2分为8端依次连接至pcr2.1质粒中,构建了一株乙脑疫苗株SA14-14-2的全长感染性克隆,并进行了拯救,结果显示转录体RNA可以在细胞中包装成完整的病毒颗粒,并导致细胞发生CPE效应,IFA结果显示拯救病毒可以在细胞胞质中表达蛋白,测序结果显示拯救病毒具有良好的遗传稳定性,上述结果初步证明了减毒乙脑疫苗株全长感染性克隆质粒的可使用性。