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托品烷生物碱(tropane alkaloids,TAs)是医学上最古老的传统药物之一,已经有近3000年的使用历史。TAs主要包括莨菪碱和东莨菪碱,这两种生物碱均可以作为抗胆碱药物在临床上广泛应用于止痛、麻醉、戒毒脱瘾、抗晕动和治疗帕金森病等。药用TAs的生产完全依赖于与从茄科特定的药源植物中提取获得,这些药源植物主要有:颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stramonium)和澳洲毒茄杂交种(Duboisia hybrid)等。在TAs药源植物中,托品烷生物碱含量极低,无法满足市场需求。如在颠茄中,莨菪碱仅为叶片干重0.02%-0.17%,东莨菪碱仅为叶片干重0.01%-0.08%。通过生物技术手段提高药源植物中TAs的含量,是目前解决TAs供求矛盾最为有效的手段,也是相关行业一致追求的目标。开展TAs生物合成途径的分子生物学研究是采用生物技术手段改造TAs生物合成途径的前提。颠茄是《中国药典》收录的TAs药源植物。近年来,随着对托品烷生物碱生物合成途径研究的不断深入,对颠茄等TAs药源植物中TAs生物合成途径中的许多相关基因进行了分离和鉴定,使通过基因工程技术在提高植物中TAs的含量成为了可能。然而,在一些TAs生物合成的关键节点,相关的研究依旧相对滞后。N-甲基腐胺的氧化脱氨是TAs生物合成的关键步骤,该反应可能是由铜胺氧化酶超家族成员N-甲基腐胺氧化酶(N-methylputrescine oxidase,MPO)催化的反应。但是编码MPO的基因还没有从TAs药源植物中克隆和鉴定,其是否参与TAs生物合成也未见报道。本研究从颠茄中克隆了两个MPO基因(AbMPO1和AbMPO2),对其进行了生物信息学分析、组织表达模式分析,并采用RNAi技术获得了颠茄转基因发根以考察其对TAs生物合成的影响。本研究获得相关研究结果如下:1.AbMPO1和AbMPO2的克隆和序列分析利用RACE技术克隆了颠茄中的两个MPO基因的全长cDNA,分别命名为AbMPO1和AbMPO2。AbMPO1和AbMPO2的全长cDNA序列分别为2747 bp和2706 bp,其编码的氨基酸序列分别编码767个氨基酸和782个氨基酸残基。AbMPO1和AbMPO2的氨基酸序列一致性为75.3%,相似度为83.5%。AbMPO1与烟草MPO1(NtMPO1)氨基酸序列一致性为84.9%,相似度为90.1%;AbMPO2与烟草MPO1(NtMPO1)氨基酸序列一致性为75.0%,相似度为83.6%。BLASTP分析结果表明这两个MPO都属于铜胺氧化酶家族,都具有铜离子结合位点。2.AbMPO1和AbMPO2的组织表达谱分析采用实时荧光定量PCR技术,对AbMPO1和AbMPO2在颠茄须根、主根、成熟茎、幼茎、成熟叶、幼叶、花和花蕾中的表达进行了分析。结果发现,AbMPO1只在根中表达,且在须根中的表达量显著高于在主根中的表达量;数字表达谱分析结果表明AbMPO1的组织表达模式与TAs生物合成途径已经基因的表达模式一致,即在须根中高/特异表达。AbMPO2在所有检测的组织中具有表达,在根中的表达水平低于地上部分的表达水平;数字表达谱分析结果表明AbMPO2的组织表达模式与TAs生物合成途径已经基因的表达模式不一致。AbMPO1和AbMPO2组织表达谱分析结果表明,AbMPO1可能主要参与TAs生物合成。3.抑制AbMPO1导致颠茄发根中莨菪碱和东莨菪碱含量下降为进一步研究AbMPO1是否参与TAs的生物合成,采用转基因和RNAi技术获得了抑制AbMPO1的颠茄发根。PCR检测结果显示,在所有发根中均能检测到626 bp的rolC基因片段、423 bp的rolB基因片段;在iAbMPO1发根中还能够检测到521 bp的35S::iAbMPO1融合片段和597 bp的NPTII基因片段,而在对照发根中未能检测到这些片段。实时荧光定量PCR检测AbMPO1表达量的结果表明,在iAbMPO1发根中,AbMPO1的表达量显著降低,而AbMPO2的表达量没有现在变化。分子检测结果表达,获得了特异性抑制AbMPO1的转基因颠茄发根。HPLC分析TAs含量的结果发现,抑制AbMPO1大幅度降低了莨菪碱和东莨菪碱的含量。对照发根中莨菪碱含量为2.85 mg/g干重,东莨菪碱含量为1.53 mg/干重。在AbMPO1抑制的发根系中,iMPO1-7和iMPO1-8中莨菪碱为痕量,iMPO1-3、iMPO1-9和iMPO1-11中莨菪碱含量分别为0.23 mg/g干重、0.89 mg/g干重和0.65 mg/g干重;这些发根系中东莨菪碱含量为0-0.50 mg/g干重。这些结果表明,抑制AbMPO1能够大幅度降低TAs的含量,表明其参与TAs生物合成。4.抑制AbMPO2对颠茄发根中莨菪碱和东莨菪碱合成没有影响为考察AbMPO2是否参与TAs的生物合成,采用转基因和RNAi技术获得了抑制AbMPO2的颠茄发根。PCR检测结果显示,在所有发根中均能检测到626 bp的rolC基因片段、423 bp的rolB基因片段;在iAbMPO2发根中还能够检测到514 bp的35S::iAbMPO2融合片段和597 bp的NPTII基因片段,而在对照发根中未能检测到这些片段。实时荧光定量PCR检测AbMPO1表达量的结果表明,在iAbMPO2发根中,AbMPO2的表达量显著降低,而AbMPO1的表达量没有现在变化。分子检测结果表达,获得了特异性抑制AbMPO2的转基因颠茄发根。HPLC分析TAs含量的结果发现,对照发根和iAbMPO2发根中莨菪碱的含量处于无显著性差异的同一水平,东莨菪碱的含量也处于无显著性差异的同一水平。抑制AbMPO2的相关研究结果表明,AbMPO2不参与TAs的生物合成。综上所述,本研究从颠茄中克隆和鉴定了属于铜胺氧化酶家族的两个基因,AbMPO1和AbMPO2。虽然AbMPO1和AbMPO2的氨基酸序列高度相似,但其表达和在TAs生物合成中的作用完全不同。AbMPO1在颠茄具有根特异性表达特征,且在须根中表达最高,与TAs生物合成部位及TAs生物合成基因的组织表达模式一致;抑制AbMPO1导致TAs生物合成受阻;AbMPO2在组织表达模式上与TAs生物合成基因表达模式不同,抑制AbMPO2对TAs生物合成没有影响。本研究不仅确认了AbMPO1参与TAs生物合成,也为今后开展TAs的代谢工程提供了一个有价值的基因。