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第一部分影响胃癌新辅助化疗效果的临床病理因素研究背景及目的:新辅助化疗是进展期胃癌综合治疗的重要组成部分,新辅助化疗的效果对胃癌病人预后至关重要,新辅助化疗后肿瘤组织的病理缓解程度能够反映新辅助化疗的效果。然而,在胃癌新辅助化疗的相关研究中,临床病理因素与新辅助化疗效果的相关性研究还鲜有报道。在本部分我们拟通过回顾性研究,先进行新辅助化疗联合手术联合辅助化疗与手术联合辅助化疗的疗效对比,以期明确新辅助化疗的效果;进一步分析影响胃癌病人新辅助化疗效果的临床病理因素,为提高胃癌新辅助化疗的效果提出建议。研究方法:首先回顾性分析北京协和医院2012年至2016年本专业组新辅助化疗联合手术联合辅助化疗与其他组手术联合辅助化疗两种治疗模式对进展期胃癌病人预后的影响;然后回顾性分析北京协和医院2016年至2019年本专业组接受SOX方案（奥沙利铂+S-1）新辅助化疗后行根治性手术的胃癌病人,收集病人临床病理资料后分析其对新辅助化疗效果的影响,新辅助化疗效果的判断采用美国病理学家协会（College ofAmerican Pathologists,CAP）分级。单因素分析采用卡方检验或t检验,多因素分析采用Logistic回归检验,受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）分析用于判断影响新辅助化疗效果的关键性因素的截点值。研究结果:在新辅助化疗联合手术联合辅助化疗与手术联合辅助化疗的比较中,两组分别纳入218例和232例进展期胃癌病人,结果显示新辅助化疗组有着更高的R0切除率（P=0.014）,更低的术后病理T分期（P=0.002）和淋巴结转移率（P＜0.0001）,且提高了胃癌病人的5年总生存率（59.6%vs 50.9%）。在影响胃癌新辅助化疗效果的临床病理因素分析中纳入了 203例进展期胃癌病人,单因素和多因素分析显示年龄＜60岁（OR=1.840[1.016-3.332],P=0.044）、低分化腺癌和印戒细胞癌（OR=2.606[1.321-5.140],P=0.006）以及新辅助化疗期间体重下降（OR=2.110[1.161-3.834],P=0.014）的胃癌病人新辅助化疗效果更差,三者是影响胃癌病人新辅助化疗效果的独立危险因素。体重变化和新辅助化疗效果的ROC分析显示曲线下面积（Areaunderthecurve,AUC）为 0.593（P=0.024）,体重变化的截点值是-2.95%,说明体重下降＞2.95%的胃癌病人化疗效果更差。卡方检验显示与新辅助化疗期间体重下降的病人相比,新辅助化疗期间体重未下降的病人有着更高的口服营养补充（Oral nutritional supplement,ONS）比例（82.3%%vs 70%,P=0.039）。研究结论:新辅助化疗联合手术联合辅助化疗可以提高进展期胃癌病人的预后,年龄＜60岁、低分化腺癌和印戒细胞癌以及新辅助化疗期间体重下降是影响胃癌病人新辅助化疗效果的独立危险因素,新辅助化疗期间体重下降＞2.95%的胃癌病人化疗效果更差,及时的营养支持如口服营养补充来维持病人体重对于提高新辅助化疗效果有重要作用。第二部分HNF1A-AS1在人胃癌组织及胃癌细胞中的表达及其与化疗效果的关系研究背景及目的:胃癌是全球致死率较高的恶性肿瘤之一,化疗药物耐药是造成胃癌病人预后差的重要原因。研究发现长链非编码RNA（Longnoncoding RNA,lncRNA）在肿瘤耐药中具有重要的调控作用。在本部分我们将探索lncRNA HNF1A-AS1在胃癌组织和胃癌细胞中的表达情况,进一步分析HNF1A-AS1在基于氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）的SOX化疗方案中敏感组织和耐药组织中的表达情况,寻求HNF1A-AS1与胃癌5-FU化疗耐药之间的可能联系,为后续研究奠定基础。研究方法:胃癌组织收集自胃癌病人新辅助化疗前的胃镜活检组织,正常胃黏膜组织收集自健康受试者的胃镜活检组织,胃癌细胞系采用HGC-27、MKN-45、AGS及NCI-N87四种,正常胃黏膜细胞系采用GES-1细胞系。胃癌病人新辅助化疗采用基于5-FU的SOX方案,胃癌病人新化疗效果的判断采用病理CAP分级,Real-Time PCR用于检测胃癌组织及胃癌细胞中HNF1A-AS1的表达水平,不同组间HNF1A-AS1表达水平的差异比较采用t检验或单因素方差分析。研究结果:胃癌组织HNF1A-AS1的表达水平明显高于正常胃黏膜组织,化疗耐药的胃癌组织HNF1A-AS1的表达水平要明显高于化疗敏感的胃癌组织。4种胃癌细胞系HNF1A-AS1的表达水平要明显高于正常胃癌细胞系GES-1,且HNF1A-AS1在MKN-45中的表达水平最高,在HGC-27中的表达水平最低。研究结论:HNF1A-AS1在胃癌组织和胃癌细胞中明显高表达,且在5-FU耐药的胃癌组织中升高更为明显,提示HNF1A-AS1可能与胃癌5-FU化疗耐药相关。第三部分HNF1A-AS1诱导胃癌细胞5-FU耐药的功能学研究研究背景及目的:基于5-FU的化疗方案是胃癌化疗的重要组成部分,5-FU耐药是影响胃癌病人预后的不利因素,越来越多的研究发现lncRNA在5-FU耐药中起重要的调控作用。我们第二部分的研究显示lncRNAHNF1A-AS1可能对胃癌5-FU耐药有促进作用,在本部分我们将通过一系列体外和体内的功能学实验,具体探索HNF1A-AS1对胃癌细胞5-FU耐药的作用。研究方法:采用慢病毒感染的方式,在MKN-45细胞构建HNF1A-AS1敲低稳转株（sh-HNF1A-AS1）,在 HGC-27 细胞构建HNF1A-AS1 过表达稳转株（LV-HNF1A-AS1）。通过Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验、平板克隆实验检测HNF1A-AS1对5-FU处理的胃癌细胞增殖的影响,通过流式细胞仪检测HNF1A-AS1对5-FU处理的胃癌细胞凋亡的影响,通过裸鼠移植瘤实验检测HNF1A-AS1对5-FU处理的体内成瘤的影响。研究结果:CCK-8实验和平板克隆实验显示敲低HNF1A-AS1抑制了 MNK-45稳转株在5-FU处理下的增殖能力,过表达HNF1A-AS1促进了 HGC-27稳转株在5-FU处理下的增殖能力;流式细胞仪检测显示敲低HNF1A-AS1促进了 MNK-45稳转株在5-FU处理下的凋亡,过表达HNF1A-AS1抑制了 HGC-27稳转株在5-FU处理下的凋亡。裸鼠体内成瘤实验显示在5-FU腹腔化疗的情况下,敲低HNF1A-AS1抑制了 MNK-45稳转株的体内成瘤能力,过表达HNF1A-AS1促进了 HGC-27稳转株的体内成瘤能力。研究结论:体内外功能学研究证实高表达的HNF1A-AS1可以促进5-FU处理的胃癌细胞的增殖,抑制5-FU对胃癌细胞的凋亡作用,促进5-FU化疗下的体内成瘤,即HNF1A-AS1降低了胃癌细胞对5-FU的敏感性,促进了耐药。第四部分HNF1A-AS1诱导胃癌细胞5-FU耐药的分子机制研究研究背景及目的:经过第二、三部分的研究,我们发现HNF1A-AS1可以诱导胃癌对5-FU的耐药,但HNF1A-AS1是如何发挥作用的,其中的机制还未见相关报道。在本部分我们将探讨HNF1A-AS1诱导5-FU耐药的具体分子机制,为克服胃癌5-FU耐药寻找潜在的治疗靶点。研究方法:通过双荧光素酶报告基因实验和RNA免疫沉淀实验（RNA immunoprecipitation,RIP）探索 HNF1A-AS1、miR-30b-5p、EIF5A2 间的竞争性内源RNA机制（Competitive endogenous RNA,ceRNA）;通过拯救实验探索在敲低或过表达HNF1A-AS1的胃癌稳转株中补救miR-30b-5p的表达对胃癌细胞增殖、凋亡和一系列蛋白表达的影响;Western Blot和免疫组织化学染色检测EIF5A2,E-Cadherin,Vimentin,N-Cadherin等蛋白在胃癌细胞和裸鼠移植瘤中的表达水平。研究结果:荧光素酶报告基因实验证实HNF1A-AS1与miR-30b-5p、miR-30b-5p与EIF5A2之间存在结合作用,RIP实验进一步证实了 HNF1A-AS1与miR-30b-5p的结合;补救miR-30b-5p的表达可以逆转HNF1A-AS1对胃癌细胞增殖、凋亡及5-FU耐药的作用;Western Blot和免疫组化提示HNF1A-AS1通过上调EIF5A2的表达促进了上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）;补救 miR-30b-5p的表达后Western Blot检测显示 EMT被逆转。研究结论:HNF1A-AS1通过竞争性结合miR-30b-5p,促进了 EIF5A2介导的EMT进程,从而诱导了胃癌细胞对5-FU的耐药,提示HNF1 A-AS1/miR-30b-5p/EIF5A2/EMT通路在胃癌5-FU耐药中具有重要的调控作用,HNF1A-AS1有作为治疗靶点逆转胃癌5-FU耐药的潜力。